作者syming ( )
看板Biotech
标题[求救] transformation的问题
时间Sun Feb 7 15:30:43 2010
请问一下各位大大
小弟我最近作transformation有遇到一些问题
这实验在重复实验下 一只出现相同的问题
就是我将vector(pet21b≒5 kb) + insert (≒0.6 kb)载入competent cell (DH5a)
涂plate overnight 只有一个colony 然後我在去挖出来LB培养
之後有再用抽取plasmid 确定是否有ligation成功
可是跑出来的电泳胶片(0.7%) 只有约3 kb
insert 来源从胶片回收与 PCR得到 insert 电泳测试皆为0.6kb
最後都得到的plasmid结果band (3kb)
若是vector没切乾净的话 应该至少也要有5.X kb吧?!
已经卡关卡了好久都是一样的结果
所以想要请问各位前辈
是我的plasmid 不适合DH5a吗?
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.113.77.200
※ 编辑: syming 来自: 140.113.77.200 (02/07 15:32)
※ 编辑: syming 来自: 140.113.77.200 (02/07 15:34)
1F：推 kaifish:建议先linearize plasmid後，再估计大小会比较准确 02/07 15:50
2F：→ syming:如果没有linearize的话 不是只会差1kb左右吗? 02/07 16:06
※ 编辑: syming 来自: 140.113.77.200 (02/07 16:07)
3F：→ bee921:我认为supercoil form程度不同 就会得到不同结果 建议切一 02/07 17:56
4F：→ bee921:刀 02/07 17:57
5F：推 licat:建议你去找附近cloning作得很顺的人仔细讨论你的实验 02/07 18:16
6F：→ licat:cloning失败 每个步骤都可能有问题 02/07 18:18
7F：→ licat:trouble shooting对新手来说蛮难的 别害羞直接去找人讨论吧 02/07 18:19
8F：推 inchew:其实也可以直接PCR来看 看circular form真的不准 02/07 20:17
9F：推 icome:只有一个colony很有可能只是杂菌.. 02/07 21:18