※ 引述《[email protected] (我家有只可爱小都)》之铭言： > 最近做了transfection, > 用lipofectamine transfect 一个带有GFP的plasmid, > transfect完隔两天,萤光显微镜下看到有发绿色萤光的细胞约50%, > 之後我就继续用加了G418的medium筛, (plasmid上有neomycine resistance gene) > 细胞持续养了两个礼拜, 可是这段期间有绿色萤光的亮点却越来越少, > 今天看大约只剩10~20%了. > 细胞的型态都正常,存活数量也持续增多, > 抗生素的浓度我是参考过许多相关paper的浓度. > 到底是甚麽原因呢? > 以下是我的想法,若有观念错误请大家指证: > 我的plasmid上是用CMV promoter, > 照理说,GFP gene在真核细胞内应该会持续被活化表现, > 细胞内应该一直会有GFP protein. > 所以若细胞有这个plasmid, 应该会持续散发绿色萤光. > 那麽在抗生素筛选下,细胞数量也有增多,为何发萤光的细胞数量越来越少呢? > 请大家指点我是否有观念错误, > 谢谢! :) 可以请问你G418的浓度你有自己做过killing curve吗? 因为每种细胞每个人养起来不同 参考paper是用来抓约略范围的 听起来你的细胞是生长很快的那种 我之前也遇过类似问题 在测killing curve後 你可以挑选你希望杀死细胞的天数的G418浓度 一般作stable clone会挑选10天杀死细胞的抗生素浓度 我想你可以挑选早一点(例如7天)杀死细胞的抗生素浓度 另外 还要注意细胞满度 细胞过满时对抗生素不敏感 -- ※ Origin: 交大次世代(bs2.to) ◆ From: 140.116.194.55