作者uokoperfect (病态)
看板Biotech
标题[求救] 请问各位'
时间Fri Jan 22 18:07:38 2010
假设今天P了两段PCR产物
两段PCR产物5'跟3'各有100多个mer重复
A产物
5'--------------------------3'
3'--------------------------5'
5'-----------------------------3'
3'-----------------------------5' B产物
如何把它们结合成一个完整的序列了(因为这个基因全长我抓不到条件 所以p成两段)
一样用pcr的方法吗
先加热再结合 再延长?
我有点不懂为什麽博士要klenow fragment来做
直接用taq 不行吗
请各位帮我解决
谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 60.249.152.174
1F：推 TOTO:这个应该直接用一般pcr方法做吧，省去94'C 3min这个第一步 01/22 21:33
2F：推 ookubo:A产物forward + B产物reverse primers 用PCR就好了 01/22 21:44
3F：→ ookubo:用pfu是为了降低一般Taq的错误率 01/22 21:45
4F：→ nike77114:楼上他用的是klenow fragment跟pfu有啥关系= =? 01/22 23:38
5F：→ nike77114:klenow fragment的特性是5'-3' polymerase activity 01/22 23:38
6F：→ nike77114:3' → 5’ exonuclease 这样原PO大概知道为啥要用 01/22 23:39
7F：→ nike77114:klenow fragment了吧@@? 01/22 23:39
8F：→ nike77114:只是我如果没记错的话好像要控制好klenow fragment 01/22 23:45
9F：→ nike77114:维持两种活性的平衡= =不然做出来又被吃掉 01/22 23:45
但是整个实验 我应该没有要用到3' → 5’ exonuclease阿
因为我是要这个基因的全长
3' → 5’ exonuclease 是要减少复制的错误率吧
这样应该可以选用 有proofreading的 taq就好 不是吗?
否则选要 kleonow 还要控制温度....
不是多此一举吗?
还是各位有别的看法
因为我对klenow这个酵素的用处真的不太熟悉
假如要延长的话
是先让两股分开
然後彼此的重复的地方会粘上
那这样tm值要怎麽控制呢
因为我没做过类似这样的实验
希望大家帮忙解惑一下
※ 编辑: uokoperfect 来自: 124.9.207.51 (01/23 00:51)