作者keepseaching (绝心忘情)
看板Biotech
标题[求救] plasmid rescue
时间Sat Dec 19 18:11:28 2009
各位板友好
目前我在从事的实验是
监定水稻转殖株t-DNA插入的位置
所用的protocol如下
1. 抽取水稻gDNA，取5ug用Spel进行截切overnight
2. 65度inactivate enzyme，加入NaOAC与IPA沉淀，再用70% EtOH wash，离心
3. 以分生用去离子水回溶利用T4 DNA ligase进行ligation overnight
4. 65度inactivate enzyme，以heat shock的方式进行transformation
5. 利用含有Amp的medium进行筛选
6. 挑colony，抽plasmid，以Xbal进行digestion check
利用Xbal截切的结果
应该要有一条3.3 kb与另一条大於3.7 kb的band
但是大部分出来的结果
不是一条band
就是size不合
我知道这个方式成功率本来就不高
所以想请问各位版友
如何修改protocol以增加实验成功率
谢谢
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