关於qPCR 很奇怪的状况 小弟我最近qPCR 遇到很奇怪的状况 想请问各位先进的意见 小弟我目前的实验室 有把我们要研究的某基因在MCF7 上做Stable expression 称之为O2 那empty vector control称之v2 我接下来用o2/v2称呼其 自从年中(8月)开始 我们实验室取新的o2/v2测该基因的qPCR表现程度 一切都如预期的 o2的表现量是v2 的8倍 这个正却性很高 因为我们实验室除了我以外另外一个助理也一样测出相同的效果 後来用western blot看蛋白质的表现量也有明显的不同 但是自从9~10月开始 我又从新用qPCR测该细胞的表现状况 赫然发现我做不出来 02/V2的表现状况尽然差不多 当时我和我老板讨论後认为可能是我们QPCR机器出问题(当时也的确出了一点问题) 太久没有calibration (大概5年以上没有人去calibrate过) 所以我停做qpcr一个月 直到11月中我重新calibrate 然後我再上个星期又做了一次 结果这次结果还是一样 O2/V2的表现状况还是1:1 做不出8倍 但是我回头看这几次的原始SDS档案 我发现很有趣的事情 凡是我们实验室每次有做成功 每一个sample 18S CT VALUE 都是5左右 我做失败的 每一个sample的18s CT value 都是8上下 所以我的假想是 可能我做实验到抽RNA这段期间 细胞发生了一些状况 导致细胞的expression pattern产生变化 等致就连不因该变动的18s 表现状况都出问题 ct value 从5 降到8 表现量可视降了2的三次方倍 当时我跟我老板提的假设是 因为我之前有次做si-RNA实验失败 那次失败的原因疑似因为transfection reagent没有mix 好 plate底部分不不均 而transfection reagent在某些地方浓度过高 毒死细胞造成细胞stress 再那一次的实验中 我的18s ct value有从5~8的range 所以我的这次假设是 也许我的细胞在seed以後只放了24小时就抽RNA 也许导致细胞某种程度也是处於STRESS 所以expression pattern大乱 放48小时(我那次做成功是放48小时)在抽会有比较正常的expression pattern 但是我今天和别的实验室的学长聊这一点的时候 他的看法是 我的细胞一定是处於某种stress 但是因该不是单存24小时seeding的问题 因为他也有养一样的细胞株 然後他也是seed 24小时以後就抽 也从来没有发生过什麽事情 所以他认为最快的方法是换cell line 而我听他这样讲仔细想想也想到另一种可能的stress 因为我们实验室一值是用trizol来抽(那个学长的实验室也是) 但是大概9~10月开始我们改用qiagen的RNA easy kit来抽 RNA easy的lysis buffer不像trizol那麽强 所以我都是先trysinized, 然後离心一次产生pellet 然後再用PBS离心, 洗去medium, 然後加lysis buffer 我在想说有没有可能我这样子做会产生stress 导致其expression pattern改变呢? 请问各位的看法又为何? 有人遇到过类似的状况吗? -- 我的blog 欢迎参观 http://www.wretch.cc/blog/reinherd --

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