作者mzac1b (Goodday)
看板Biotech
标题[求救] 请教ㄧ些关於跑flow protocol 的问题~~
时间Fri Nov 27 05:50:26 2009
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
我买了一些抗体如这支
Fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-mouse/human CD44 (Pgp-1, Ly-24)
http://www.ebioscience.com/ebioscience/specs/antibody_11/11-0441.htm
要分析一些贴附细胞, 其中 CD44+ 占所有细胞的比率
我去找了一篇文章想参考其ptrotocol
Transplantation of adipose-derived stem cells overexpressing hHGF
into cardiac tissue
Biochemical and Biophysical Research Communications 379 (2009) 1084–1090
其大略protocol 如下:
1. 10^5 cells were resuspended in 200ul PBS containing 0.5% BSA
(bovine serum albumin)
2. incubated 30 mins at 4度 with fluorescence-labelded antibodies
against CD44
3. After washing with PBS with BSA 3 times, the cells were suspended
in PBS and analyzed by flow cytometry
由於我之前没做过flow 分析, 我这边ㄧ时也找不到人问
心中有许多疑问
想请问众先进们~~
1. 我参考那篇文章的protocol, ok 吗?
2. 为什麽它的PBS要加5%BSA? 不加的话会有影响吗?
3. 有的protocol 还会在PBS 加 Ca+2 or Mg+2
为什麽? 有需要吗?
4. 为什麽有的protocol 说要用staining buffer? 如下这个protocol
http://www.imgenex.com/getfile.php?manual_id=42
staining buffer 有差吗? 有需要吗?
5. 如果flow 读得到萤光值 (如FITC 的萤光)
萤光显微镜看得到吗?
我是说会不会 flow 读出差异, 但在一般萤光显微镜弱到看不到?
感谢指教~~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.93.58
1F：→ missoul:通常添加albumin Ca2+ Mg2+有维持细胞活性的目的 11/28 10:40
2F：→ missoul:或许跟上机的细胞是否死的有关 或者维持细胞的原型吧(?) 11/28 10:41
3F：推 purineboy:如果你的萤光强度在10^2以上，萤光显微镜可以看到 11/29 19:25
4F：→ purineboy:有些staining buffer其实就是PBS(or T)+ blocking serum 11/29 19:27
5F：→ kotenka:我的染色buffer都没有加BSA，因为染色时间没有很长，有些 12/02 00:55
6F：→ kotenka:marker要染两三个小时的话我就会加BSA；钙和镁是一直都 12/02 00:55
7F：→ kotenka:加。FITC应该是看得到不过可能很弱或容易quench 12/02 00:56
8F：→ kotenka:第二行打错，钙和镁从来都 不 加 12/02 00:57