※ 引述《diploid (2倍体)》之铭言： : 目前我是照着实验室的protocol做,基本上跟台大庄教授的流程差不多 : 不过融了快10只都出不来,快哭死了,完全都是在烧钱T口T : 状况最佳的几次是在day 3~day 5左右还有数颗细胞存活,大概2,3颗聚集在一起 : 这些应该是有成功融出的融合瘤细胞,不过最後还是完全没继续生长&存活 : 目前想出的问题是 : 操作过程失当&无菌操作:不过以我这几次的经验我觉得完全不可能 : feeder cell:不过看了很多paper,很多人在做融合时也并未使用 : PEG:看了几个protocol,有人在加入PEG时会顺便搅拌一下细胞,或是静置数分钟 : 然後再加入media(RPMI 1640,DMEM)或PBS做wash : myeloma cell:代数过高?基因型改变? : 然後有人是直接将做完PEG&wash动作後离心下来的cell pelet不打散直接移到 : flask培养再做分盘(分到96孔盘) : 而我是加入PEG>加入RPMI 1640>离心>加HAT medium将细胞冲散>直接分装到96孔盘 : 这两个步骤的差异会对融合成功率产生影响吗? : 有经验的高手能提供一些意见吗O_Q 你用的 myeloma cell 应是 NS1，我们用的是 SP2/0-Ag14，除了 medium 是 RPMI1640 外，其他应该没什麽差别。 我们的 Protocol 简述如下： [METERIALS] RPMI1640 200 mL RPMI1640 (15% FBS) 50 mL with 50X HAT (Sigma H-0262) 1 mL PEG 1500 (Roche 783 641) 0.7 mL 请指明使用罗氏，其他牌子效果有差 Myeloma cell (NS1) Flask T75 约 7~8 成满，细胞数 10^7 以上 50 mL tube x4 Petri dishes x3 保丽龙板 x1 手术台 96-well Plate x3 大头针 x12 1L 或 0.5mL 烧杯 x1 Timer x1 灭菌手术用具组 x1 五剪十镊 针筒 x1 [METHODS] 1.操作前准备： 前一天 Myeloma 依状况换掉一半 medium。 30 分钟前，1L 烧杯装超纯水、200 mL RPMI1640 及 50 mL RPMI1640 (15% & HAT) 回温备用。 2.以二氧化碳将小鼠牺牲，喷75% 酒精至毛微湿，移入laminar flow ，以大头针 大字型固定在包覆铝箔之保丽龙解剖台上。 3.工字型剪开腹腔，先剪表皮，固定後再剪开真皮 (勤换镊剪，小心勿污染)，剪 开胸腔可见心脏仍在跳动，以针筒直接刺入心脏采集全血 (约0.5 mL)。 4.由根部剪下脾脏 (位於左腹长条囊状深褐色，勿剪破！)，以3个 petri dishes 的 RPMI1640 洗净 (洗时尽量去除白色组织)。 5.最後 petri dishes 中，以针头密集刺脾脏，针筒抽 RPMI1640 注入脾脏内冲洗， 直至脾脏扁掉颜色变淡。将冲洗後之 RPMI1640 倒入50 mL离心管，置於 CO2 Incubator 静置 5 min (使组织碎片沉降)，倒入新离心管，补 RPMI1640 至 30 mL 後与 Myeloma 同时离心 (900 rpm, 10 min)。 6.冲下 Myeloma，倒入新离心管，补 RPMI1640 至30 mL与脾脏细胞同时离心 (900 rpm 离心10 min) 後倒掉上清液，沉淀以指侧轻敲余液打散後加入新DMEM，此步 骤重复二次。(利用空档，PEG 置於 CO2 Incubator 回温，并以血球计数器计算 脾脏细胞与 Myeloma 数目) 脾脏约是 Myeloma 数目的 3~10 倍 7.混合 Myeloma 与脾脏细胞，补 RPMI1640 後以 900 rpm 离心 10 min，後尽量 倒掉上清液，沉淀以指侧轻敲余液打散。 8.於温水上边加边摇晃tube，加入0.7 mL PEG，摇晃1 min，缓慢加入 2 mL RPMI1640， 加入 8 mL RPMI1640。马上以 800 rpm 离心8 min，尽量倒掉上清液，沉淀以指 侧轻敲打散後补余下之 RPMI164。 9.以 800 rpm 离心 8 min，沉淀以指侧轻敲打散後加入 50 mL DMEMX-HAT。 10.以无菌塑胶滴管分装至 3 盘 96-well plate (每 well 3 滴共 150 μL， 边加边摇晃)。融合细胞置 37℃ CO2 Incubator 培养。 [细胞融合後步骤] 1.Fusion 後一周：显微镜检，圈选有稳定细胞丛的 well，计算 fusion ratio。 若培养液蒸发太多，每 well 补一滴培养液。 视情况而定，请不要 medium 都快满了还硬要滴，这样很容易污染！ 2.Fusion 後二周：大部分有长细胞的 well 之培养液变黄後，吸取 100 μL 培养液 (可稀释 2~5 倍，或用原液) 至 ELISA plate 中 (ELISA plate 请事先 coating antigen，并 blocking) 进行 ELISA 效价测试，补 100 μL RPMI1640 (10% FBS, 1/2HT) 回 fusion plate 中。 为确保 ELISA 试验结果可信，请设计二重覆实验。 3.Fusion 後二~三周：若融合细胞长得较慢，可稍微延後几天让细胞长得满些 再测效价，ELISA 效价测试结果为正者，尽快进行限数稀释，若有效价之 well 数目太多，可移至24 well plate，每个 well 拷贝一份冷冻起来保存。 4.限数稀释：当融合细胞长八成满时 (此时细胞较健康)，细胞密度为 ~2 x 10^6 个/mL，理论上稀释成每 well (100 μL) 有 1 个细胞即可得到 单株细胞，事实上单独 1 个细胞容易死亡，可调整细胞密度至 2~5 个/100 μL， 让多余的融合细胞充当「饲育细胞」，这样限数稀释的成功率会大为提高。 快速限数稀释：若 well 里的细胞丛不大，显微镜下目视细胞数目 ≦ 1 成左右， 可将细胞丛打散，直接吸取 medium 至 30 mL DMEMX (10% FBS) 摇匀後分装至 96 孔培养盘中 (每 well 两滴或 100 μL)。 5.限稀後一周：显微镜下检视是否有单一细胞丛并圈选之，限稀後一周才镜检的 原因是此时细胞丛长的比较大较容易分辨，且较不会形成假的细胞丛 (原本在 同一个 cluster，拿 plate 时震脱後继续形成cluster)。每 well 补 RPMI1640 (10% FBS) 一滴或 50 μL。 6.限稀後二~三周：检视 medium 有无变黄，若细胞丛不够大，可将细胞丛打散以 加快细胞生长，吸取 100 μL 培养液 (可稀释 2~5 倍，或用原液) 至 ELISA plate 中 (ELISA plate 请事先 coating antigen，并blocking) 进行 ELISA 效价测试， 或 copy 细胞至 24 孔盘培养，取变黄的上清液进行 Western-blot 效价测试。 效价测试请尽量在一个礼拜内完成，若超过一个礼拜请检查单株细胞是否长满， 若长满请将细胞丛打散，抽走一半以上的细胞，以维持细胞的生长。 7.细胞株放大：有效价之细胞株转至 24 孔培养盘，过3~4 天後转至 T25 Flask 或 T75 Flask，再过一个礼拜後即可长满 Flask。 8.细胞冷冻：T25 分装成 2~3 个冷冻小管，T75 分装成 5~6 个冷冻小管。 依你的情况，有可能是你的 myeloma cell 不行了 (变性) 或污染 (mycoplasma) 再买新的细胞株吧！也不贵，大概几千块而已。 --

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