作者pinkcycle (circle)
看板Biotech
标题[求救] EMSA的supershift
时间Mon Sep 14 20:24:20 2009
这是我帮同学代po的,请有EMSA经验的大大看一下m(_ _)m
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我的EMSA的supershift一直做不出来,
而且smear超严重,完全看不清楚band,
我们是用Thermo Scientific的EMSA的kit去做,p65的抗体是millipore,
我们一开始有跟着学长姐的方法做,一开始有做出来,但是不明显,
後来就完全失败,最後我们有试着调整抗体的量,
由3.5ul->1ul,1ul是抗体的datasheet建议的量,但完全做不出来,
可是应该不是抗体的问题,因为我们一开始就是采分装的,每次都会拿新的,
至於smear的问题,我们有试着调高poly(dI-dC)的量,另外又加入6%的bsa,
但smear还是非常严重!
这是我们设的条件:
p65 antibody ctl
DDW 3-X 4-X
10X binding buffer 1 1
1μg/μl poly(dI-dC) 3 3
50% glycerol 1 1
1% NP-40 1 1
100mM MgCl2 1 1
6%BSA 1 1
40 pmol/μl unlabeled NF-κB DNA 0 0
P65 1 0
protein extract X X
200 fmol/ul biotin-labeled NFκB DNA 1 1
total volume 13μl 13μl
请问各位大大supershift做不出来以及smear严重,
可能的原因和可以改进的地方在哪里吗?
感谢!!
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1F：→ bobbygau:有图有真相 09/15 12:55
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