作者runpapa0520 (PAPA)
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标题Re: [求救] PCR结果定序出来的序列不是我要的!!
时间Mon Aug 24 22:23:30 2009
首先要问你pcr产物多长
跟你预设的结果长度相同吗? 不同也不用玩了
通常>500bp以上，会建议送2端去定序 (因为一般极限为7-800bp)
forward primer 订序结果直接用
reverse primer 定序结果要先reverse & complement
通常中间会有重复的 可以合并起来
如果长度适当 forward primer的结果会看到 reverse primer 的序列
reverse primer定序结果会看到 forward primer 的序列
互相比对一下就可以得到全长了
ps 如果产物很长 可以在中间加一primer去订序
通常都是接到vector上後再用vector上已知的primer去定序，
这样才能看到pcr用的primer序列。
假如这样你都比不出来 我只能说
你真的pcr到路人甲了，primer特异性不够。
※ 引述《mini188 (迷你邀霸罢)》之铭言：
各位好
我之前PCR跑出一段序列後 送去定序
我将原来primer和定序结果blast 但是没有相似的地方
於是我将序列reverse 也不行
我又将序列 reverse & complement 也不行
用了forward 和 reverse的 primer 都没对到
定序的PEAK很漂亮没问题
那请问各位 为啥之前我的PCR可以做出很shape的band?
annealing temp 是60度 应该不至於会有non-specific的问题吧?
不知道是定序方面出问题还是我的PCR出问题
但若是PCR有问题 那之前跑出的band是什麽东东??
不知道大家有什麽想法?? 谢谢!
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◆ From: 203.64.247.5
1F：推 jademan:那到底整段sequence是你要的东西吗? 08/24 15:57
2F：推 tsubasawolfy:对看看有没有vector的sequence.... 08/24 16:28
3F：推 bider:要不要用RE check片断大小是否正确 08/24 16:30
4F：推 kemp6611:DNA直接跑PCR，primer後面20-30bp无法定序出来~是正常的! 08/24 20:13
5F：→ kemp6611:所以做DNA比对~当然是不可能比对到primer序列... 08/24 20:14
6F：→ kemp6611:做cloning才有可能得到完整的DNA序列 08/24 20:14
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◆ From: 118.167.26.116
7F：推 egoweaver:推PCR到路人甲XDD 这串的原PO有试过直接把定序结果拿去 08/24 22:50
8F：→ egoweaver:NCBI BLAST看看是谁吗？ 08/24 22:50