作者tsubasawolfy (悠久の翼)
看板Biotech
标题Re: [求救] 成功不了的TRANSFORMATION(定点突变)
时间Sat Aug 15 10:57:46 2009
※ 引述《john00300j (憨憨)》之铭言：
: 有附COMPETENT CELL，不过老师有说过我们的DNA无法在他附的COMPETENT CELL表现，所以采用我们自己另外买的
我猜你们老师是想要省一步所以用BL21下去做transform吧?
猜测省下转换strain的部份
一般:
mutaion PCR->跑胶确定primer work(site direct PCR成功取决於primer)
->transform into apporiate competent cell
->blue/white screen->挑菌或colony PCR->Mini->抽plasmid->定序-> Maxi(或省略)
->transform in to BL21 and express protein.
invitrogen那套site direct kit刚刚看了他用的competent cell是用DH5A-T1R
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/oneshotdh5at1r_man.pdf
里面有写到这株菌本身不需要IPTG去induction lac promoter 自己就可以表现lac
所以如果用的是pET系列应该不用担心这问题吧? (看到BL21就直觉想到宠物系列orz)
不过你老师考量的似乎不是这点...
另一点是BL21里面的DNA replication跟repair有被修过嘛?
(因为不知道哪种你用的是哪一种BL21..)
linear form的DNA进去会不会被当成外来的直接分解掉 或者BL21有办法把它接成
circular form?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.174.118
1F：推 john00300j:恩 我们老是好像是没有要我们去选，直接要我们每个COLO 08/15 22:59
2F：→ john00300j:NY抽出送定序 08/15 22:59
3F：推 john00300j:有寄信回应了， 谢谢你这麽详细的帮助 08/15 23:14