可是有一点我得补充 如果只是做D70E或者R242A的单点突变的话 这样的诱导都是可以成功的 但是两个同时的话,就不行 当然有可能像是你们所说的folding出了问题 或许会试看看加ㄧ些可以促进chaperone表现的物质进去看看吧 至於IPTG的浓度 我不确定uM的等级是否足够 因为我用的是strigent的表现系统 BL21 (DE3)/ pLysS 我不晓得会不会是我太晚诱导的结果 不过我不太晓得太晚诱导是否是导致protein无法成soluble form的原因 还得看看才知道 很感谢你的回答 最近可能得密集试不同的条件了 大家有不一样的想法 欢迎一起讨论喔 ※ 引述《nzj (edger)》之铭言： : 我不太清楚你的实验目的为何,不过从结果来看,可以推论这蛋白质的稳定, : 离子键扮演重要的角色,因此当D变成E的时候,因都带负电所以没什麽影响, : 可是当带正电Arg变成不带电的Ala,因此无法形成离子键,因此会影响蛋白 : 质的稳定,因而影响摺叠。 : 在实验的部份,用低温的策略是可行的,不过转速可以调慢,慢慢震荡就好了, : 另外表现时菌液的浓度O.D.600=0.8有点高,也许可以试试0.4-0.6。而IPTG : 的浓度uM等级就可以了。如果再不行的话可以加3-5% 的ethanol促进 : chaperone的表现,也许可以帮助摺叠。表现的部份就试条件,也许运气好就 : 让你试到了。 : 当然也可拿inclusion bodies来做refolding,这个方法也不见得会成功 : 。可以将inclsion bodies溶在urea或者guanidium chloride然後将 : solution慢慢倒入refolding buffer,使urea的浓度降到1.8-2.3 M。 : 另外也可将溶在urea的proteins以梯度透析的方式降低urea的浓度, : 避免浓度变化过快,而影响proteins folding。另外也有一种方法就 : 是改变pH值将cofactor加入。方法有很多,不过还是要看蛋白质的特性。 : 如果还是不行,就试试不同的表现系统,如真菌的yeast。glycosylation : 会稳定蛋白质的结构,也许可以帮助蛋白质摺叠。 : 另外很多膜蛋白不溶於极性的溶液中,因此加入detergent,来帮助solubility。 : 这个方法可用来养晶。 : ※ 引述《BLACKOA (OA)》之铭言： : : 大家好,小弟在蛋白诱导上遇到了一个问题 : : 我想要诱导的蛋白原本是在D70E有做改变 : : 然後我在BL21/pLysS,在pET15b(low copy number)上做诱导 : : 简单的诱导过程如下: : : 1. O/N culture in LB with antibiotics and 0.1% glucose : : 2. 1:100 diluted in 200ml LB (500ml flask) with 0.01% glucose : : shaking culture at 37度C, 200 rpm until OD600 reaches 0.8 : : 3. add IPTG to final concentration 1mM and shaking culture at 18度C, 200rpm : : 4. 1 hour later, collect bacteria and disrupt them : : 5. pellet and the supernatant of the disrupted bacteria were collected : : 6. western blot : : 基本上是这样,然後可以看到只有D70E突变的蛋白可以明显诱导出来,而且是 : : soluble form居多(因为可以在disrupted bacteira的supernantant看到诱导的蛋白) : : 可是 : : 假如同时做R242A的突变时(也就是现在的蛋白同时有D70E跟R242A的突变) : : 在同样的系统与条件下诱导的时候 : : 却发现蛋白主要都是在inclusion body里面,几乎都是insoluble form : : 觉得很奇怪 : : 不晓得有没有人对於这个有任何想法吗? : : 我自己正在试降低IPTG的浓度(想要试0.5mM, 0.1mM, 0.05mM), : : 然後想要把induction的温度降到16度C : : 想要试着降低诱导的速度 : : 看能不能改善蛋白的溶解度 : : 不过, : : 想在这边跟大家请教看看有没有别的想法 : : 谢谢 --

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