作者coconutt (人生就是挑战挑战)
看板Biotech
标题[求救] 有关western blot 问题 请大家帮帮忙
时间Sun Jul 5 21:38:18 2009
大家好 因为工作所以开始接触western blot 大约快两个月
之前只有在教科书纸上谈兵
现在用的protocol是实验室建立起来的 当初有看实验室的人做过
但是大约做了两个月的我 一直有几个问题 搞不定 弄的自己心烦老师也不耐烦
想请各位高手指点一下问题到底出在哪边？
1.首先在收蛋白质部分 我收的量每次都低於200ug？
先讲我的方法: 我将"10 cm dish" "八成"满且细胞不是很大的dish,去medium,
wash PBS,在去掉PBS,後加入1ml的PBS,刮下（有用显微镜确认都刮下）
离心5000rpm 5min,去PBS後依照pellet加入MENT+Protein inhibitor
cocktail(1000:10)大约都加50-100ul并打很散,而後放在冰上每十分
钟又去强力冲pellet,共30分钟,而後甚至放到-80度冷冻15分钟在解冻
（现在我还加上sonicate 10分钟 每十秒休息五秒然後13000rpm 30分钟
吸上清液（有小心不吸到pellet)只是有时候液面好像有一层膜,那到底
是什麽东西？
之後就2ulsample protein+ 18ul ddw +480 ul Bio-rad protein assay
测吸光值每次R大约在0.975-0.995（每次都做standard)
但每次我的蛋白质量都低於200ug.....真的很想哭 每次做三次就没了？
到底问题出在哪边呢,实验室每个人也是这样做 他们都可以收到500ug以
上,请大家帮帮忙 谢谢
2.再者更严重的问题是,到目前为止 我的tubulin 总是不会等量 真的除了手残外
没有其他原因了吗？到目前不下跑过20多遍的western blot,但每次的tubulin都不
equal,所以每次压出来想看的蛋白都无法比较,让老板非常不满.
我还是把我的作法讲一下 请大家提点一下,其中有几个小问题 也麻烦大家解答一下
我会算好50ug蛋白所需要的ul加入4xdye,补lysis buff都到40ul离心,夹防爆夹煮沸
10min,放冰上,再离心,然後加入well内,问题来了,明明我每个sample理论上应该都是
40ul但是每次在pillet入well时都不到40ul,我问我同事他们说里应该都超过,但为什
麽我会不足？（我有确定并没有加错或是没有加到）所以到底为什麽会不足呢？
之後跑80V 5%stacking gel理论上应该我的loading的sample应该此时都聚集一条线,
而後才会进入10%的下胶但是我发现我们家跑的都有拖很长（大约3/4个well长度),一直
到下胶跑到最後的1/4处才会慢慢压成一条线？请问这是正常的吗？是哪边出了问题？
这会影响到我的结果吗?
之後就用300mA转3小时然後blocking 1hr,wash three times,加入一抗4度overnight
隔天wash three times, 二抗一小时,wash theree times again然後ECL显影
然後心情就开始不好了......因为tubulin都不equal(因为我要压的有在20-30kb
所以没压actin
很感谢你把这篇文章看到这边,如果你有任何想法或是哪边有问题,我会马上再解释清楚
也希望你觉得我哪边可以怎麽做 也麻烦你解答一下...十分感激你
谢谢大家
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 123.205.33.179
1F：推 ranilla:lysis br.加太少，会影响细胞lysis的程度，导致蛋白量少 07/05 22:22
2F：→ ranilla:你需要比较一下，对於10cm dish,其他人加的量 07/05 22:22
3F：推 ranilla:另外，打的太散，DNA沾黏的蛋白也会便多 07/05 22:25
4F：→ ranilla:sample dye沾黏tip的情形很严重，本来就会减少一些 07/05 22:28
5F：→ ranilla:300mA 3hr时间有点久，但如果你实验室大家都麽做就没差 07/05 22:31
6F：→ ranilla:40ul是全加吗？还是取10ul分四片跑？ 07/05 22:32
7F：→ ranilla:若是分片加，每管的蒸发率可能造成tubulin不一致 07/05 22:34
8F：→ ranilla:但不应该这麽大到影响定量，采用别的internal control? 07/05 22:35
9F：→ ranilla:比如说，看不同处理neural分化程度时，不适合用actin 07/05 22:36
10F：→ coconutt:我是每个处理50ug 所以弄成40ul到每个well 07/05 22:51
11F：→ coconutt:如果要做两片的话我是各别加入50ug到两个eppendorff 07/05 22:53
12F：→ coconutt:不好意思我有点不懂"DNA沾黏的蛋白"为何会影响蛋白质量？ 07/05 23:09
13F：→ ranilla:不同管的细胞核被打破的程度不一，因为你文中有提到你有用 07/05 23:13
14F：→ ranilla:sonication 07/05 23:13
15F：→ ranilla:就像抽plasmid时< 07/05 23:14
16F：→ ranilla:有时过份trypsinized的cell culture也会看到黏在一起的 07/05 23:17
17F：→ ranilla:细胞，这样离心时，那些细胞或蛋白就一起被离掉了 07/05 23:18
18F：→ ranilla:plasmid那段为错推文 07/05 23:18
19F：推 tsubasawolfy:有盖紧管口煮完後离心照理说应该体积不变吧? 07/05 23:21
20F：→ wangba:sample protein 取的量有没有可能太少 导致定量不准 07/06 03:19
21F：→ coconutt:我同事是加2ulsample protein定量 他们的定量都是OK... 07/06 07:09
22F：推 Seal13:离心5000rpm??? 通常离心细胞大概都2000rpm上下 07/06 16:13
23F：→ Seal13:你的是什麽细胞呢? 07/06 16:14
24F：推 xenosdk:楼上+1 离心细胞通常是500g 请确认你rpm换算过去没超过500 07/07 11:54