哈 我再说清楚一点齁@@ 步骤是 1. transfer 完的 membrane 用 5% 牛奶blocking 1.5 h 2. 倒掉牛奶 加入 1抗 (用blocking 溶液 1:1000稀释泡成的) 3. 4度C overnight後 又 37度C 1hr 4. wash 30min (每10min换一次新的1 x TBST) 5. 加入2抗 摇 1hr 6. wash (同4) 7 加ECL 压片 我在想可能是我一抗不需要再摇37度C了齁 再稀释然後4度C overnight就好了齁@@!! ※ 引述《linwei (我会好好加油^^)》之铭言： : 谢谢大家的建议 : 我稀释的比例是 1:1000 : 然後是用5%的牛奶泡成的抗体(同时也是我们的blocking溶液) : 抗体是新泡的 (因为我是跟我同学要原液回来泡的喔) : 然後只做一次(就是全亮的这一次@@") : 我想我会再稀释我的一抗的浓度 : 譬如说我原本泡的有10c.c : 我想我会先取2c.c.出来，再加2c.c的牛奶再对半稀释 : 然後再试试看 : 谢谢大家的热心建议 :) : ※ 引述《SPK (云淡风轻)》之铭言： : : 片子都已经全黑了要嘛过度曝光，要嘛就是substrate太多，你自己去看的结果也是整 : : 片亮那就是substrate太多了啦，你加点水稀释一下。 : : 如果是抗体有问题，问题也不会出现在二抗，而是一抗乱黏的机会比较大，看是不是 : : reuse太多次了，当然monoclone的ab是比较纯比较好但也比较贵，不一定ployclone的就 : : 做不出来啊，而且也不一定每次都有monoclone的可以买。 : : 不过有没有可能是blocking没做好呢？再泡一次脱脂奶粉试试吧。再不行就残忍一点用 : : BSA去BLOCK。 : : 首先我觉得你先把一抗换新，再来把你的substrate稀释稀一点再去反应，然後在盖片子 : : 之前先关灯看一下会不会再次整片发亮。如果会的话就不要浪费片子了。 : : 另外，不知道你用的是单面片还是双面片，如果是单面的话~~你还是换一下好了，那个太 : : 敏感了，双面片就很好用了。 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 220.229.173.66