谢谢大家的建议 我稀释的比例是 1:1000 然後是用5%的牛奶泡成的抗体(同时也是我们的blocking溶液) 抗体是新泡的 (因为我是跟我同学要原液回来泡的喔) 然後只做一次(就是全亮的这一次@@") 我想我会再稀释我的一抗的浓度 譬如说我原本泡的有10c.c 我想我会先取2c.c.出来，再加2c.c的牛奶再对半稀释 然後再试试看 谢谢大家的热心建议 :) ※ 引述《SPK (云淡风轻)》之铭言： : ※ 引述《linwei (我会好好加油^^)》之铭言： : : 请益各位 : : 因为我第一次遇到这种情况@@ : : 我压的protein 是 cleaved caspase 3 : : 使用的抗体是 cell signaling 编号9661 的抗体 : : 今天我做实验 : : 压出来一整片都是黑的 : : 结果关灯发现整片menbrane都发亮 : : 我很确定我二抗没有给错啦@@ 且也有很努力的wash乾净 : : 因为抗体是跟别人要的 : : 且我同学他也没有做过这个protein @@ : : 有人跟我说 如果是 Polyclonal antibodies 的 : : 他的专一性也会比较差 : : 会是这个原因吗? : : 该怎麽改善呢? : : 希望有做过的版友可以提供我一点意见 : : 好让我下次再试的时候知道该怎麽改进@@ : : 感恩感谢～！！！！！ : 片子都已经全黑了要嘛过度曝光，要嘛就是substrate太多，你自己去看的结果也是整 : 片亮那就是substrate太多了啦，你加点水稀释一下。 : 如果是抗体有问题，问题也不会出现在二抗，而是一抗乱黏的机会比较大，看是不是 : reuse太多次了，当然monoclone的ab是比较纯比较好但也比较贵，不一定ployclone的就 : 做不出来啊，而且也不一定每次都有monoclone的可以买。 : 不过有没有可能是blocking没做好呢？再泡一次脱脂奶粉试试吧。再不行就残忍一点用 : BSA去BLOCK。 : 首先我觉得你先把一抗换新，再来把你的substrate稀释稀一点再去反应，然後在盖片子 : 之前先关灯看一下会不会再次整片发亮。如果会的话就不要浪费片子了。 : 另外，不知道你用的是单面片还是双面片，如果是单面的话~~你还是换一下好了，那个太 : 敏感了，双面片就很好用了。 --

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