※ 引述《soceress (赢了世界又如何)》之铭言： : 1.page的配方与running buffer,transfer buffer的关系 : 以前的实验室的gel用的是molecular cloning里的配方 : (30% acrylamide,1.5M pH8.8 Tris-HCl,SDS,APS,TEMED..这是下胶) : running buffer:含SDS的Tris-Glycine : transfer buffer:含SDS,Tris,Glycine,MeOH 20% : 现在这个实验室用的是 : 30% acrylamide,3.0M pH8.8 Tris-HCl,40% glycerol,APS, TEMED : running buffer:含SDS的Tris-Tricine : transfer buffer:不含SDS,其余同上 : 胶的配方主要差在SDS和glycerol ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 主要不是差在那两种喔~ glycerol只是要增加SDS gel的density 主要是差在running buffer的Tris-Glycine及Tris-Tricine 这个差很多!!! 另外 你确定running buffer含有Tris-Glycine的下层胶Tris-HCl PH是8.8吗? 印象中好像是8.45 你可能要再查查看0.0? : 请问这两种胶的用途有什麽不同呢?? Tricine的 适合用来跑小分子蛋白 resolution佳 视胶浓度的不同 小到2kDa也可以明显区分出来 一般的SDS PAGE比较没办法跑那麽仔细 原理的话就要自己去查查看噜 : 如果上面的胶配上下面的transfer buffer会不会transfer效率变差?? : 如果上面的胶配上下面的running buffer会不会有问题?? (比方说胶过烫) : 我要跑的是60~70KD的蛋白质 一般Tricine-SDS-PAGE 有分Anode及Cathode buffer PH分别是8.9及8.25 混着跑... 我也不知道会不会有问题 剩下的问题有劳其他人补充啦~ : 2.transfer的条件如果改变会影响data趋势吗?? : 用含SDS与不含SDS的transfer buffer,趋势会不同吗?? : 目前学姐们有三种条件(大家用的都不一样^^||),要看的仍是60~70KD的蛋白质 : a. 120V transfer 1.5hr : b. 100V transfer 1.5hr : c. 50V transfer 4hr : 自己是觉得应该不会改变趋势... : 我一直习惯用b,做出来和一年前刚到新实验室用a的结果相反......n=4,三重覆 : 於是试着用c,趋势和b一样 : 3.同一个sample同时load跑四片 : 染了同一个抗体,理论上4片的target protein都可以染得很清楚(这是已经确定的) : 结果固定某个检体,两片有(明显),两片没有(定量结果为0) : 听别人说可能是power supply在transfer过程中短路 : 还有没有别的可能呢?? : 感谢各位耐心看完~~~ : 先谢谢大家的帮忙~~ --

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