我是以Triton X 114 partitioning来进行membrane protein extraction的实验 但在执行上出了一些问题 想请问大家一下 这方法的原理大致上是这样的， 首先将细菌悬浮在含有1% triton x 114的buffer中， 并且置於冰上使蛋白质溶解於buffer， 接着离心去除细胞残渣， 然後转移至高温(>30度)， Triton series detergent在较高的温度时， 水溶性会降低， detergent会自行聚合， 接着再以离心的方式， 将溶液分成aqeuos phase和detergnet phase， deterent phase因密度较重，会出现於管中的下层， 而此时membrane protein就会溶於下层detergent phase。 但是在操作上出了一些问题： 首先我的实验对象是Mycoplasma fermentans， 但是我以buffer悬浮它时，并以离心去除不溶的沉淀物时， 发现含有1% triton x 114 buffer并无法对菌体产生破菌 而有大量的沉淀物出现 而这个问题似乎影响了之後蛋白质萃取的量 请问这样的现象正常吗? 如果我怀疑菌没破， 是否应该在实验开始前引入破菌的步骤(free and thaw，sonication等) 第二个是我照着protocol上讲解的操作， 发现分层并不明显，因此我改用较高比例的triton X 114进行实验 分层现象虽然明显 但却造成detergent phase中triton x 114的比例太高， 於SDS PAGE分析时影响蛋白质在胶中的移动， 可是几乎所有的protocol都是写1% tx114， 请问1% TX114会太少吗?为什麽我没办法分层呢? 第三个问题则是有些PROTOCOL上写要以swinging bucket rotor来进行离心 不过由於我没有这种设备，因此我仅使用一般桌上型的离心机来进行离心 请问这样的离心会对分层产生影响吗? --

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