※ 引述《cuteyinyin (泰迪小熊 )》之铭言： : 各位大大安安: 你好 就自己以前一些经验大家一起来分享讨论 经验不足的地方 请鞭小力点 : PI最近给我一个任务 : 要我culture "cerebullum of new born mice" : 他应该是要培养神经细胞 : 之後要用electroporation 把DNA送进神经里面...... : 但是我之前完全没有primary culture cell的经验 若你以前有培养cell line的经验 请先有一个认知 cell line & primary culture 有根本上的差异存在 : 所以想跟大家请教几个我查不到答案~ : 还有不大确定答案的问题 : 1.因为我第一次做,很不熟练, : 所以一开始花了很多时间(大约要半小时/per mice@@) : 在取出小脑,去掉脑膜,显微镜下切成小块这些步骤.... : 不知道我花这麽久的时间,会不会让细胞死了一大半??(我再切的时候 : 细胞是放在culture medium之中....medium 是依照protocol配置的) : 如果我做太久会导致细胞大量死掉的话,有没有其他方法可以补救? : (没办法我ㄧ开始真的是手残不协调...我也很想快点弄完) 首先这部分 只能说细胞死了就死了 既然都了解最大因素在"时间"上 也只能麻烦你尽快进入状况 熟能生巧 0.5hr/mice 是因为你们实验中的设计个体间有不同的处理吗? 不然就取sample这阶段 应该是一次就取一批的量才容易实验的进行吧 为求tissue 保持新鲜 迅速消毒 断头 取组织 一只速度应不需3分钟(这不夸张) 脑膜除去 熟练的话 其实很快 尤其是开脑取脑的动作做的很乾净漂亮 另请教你们是用何种方法去打散细胞? : 2.切完之後,因为没有马上要culture,所以依照protocol上面的叙述 : 把他们cryopreserve...冷冻在-70(加DMSO)....但是因为我一次要 : 牺牲五六只老鼠,cryoperserve box又不够,所以我每做完一只 : 是放在冰里面,等全部的sample都弄完了再一起放进-70 : 上次我ㄧ共花了三个小时才做完全部><(五只)...请问 : 这样子细胞会死光吗??还有~我问我们那边的博士後~他跟我说 : (他是日本人)在他们那边,他们神经细胞不冰-70度, : 都是马上culture起来,因为神经细胞冰起来很容易死掉 : 就算是放了DMSO也一样...但是因为paper上面是写可以冰起来 : 我又查不道这方面的资讯..所以想要确认一下哪个才是对的>//< 这地方很奇怪 tissue处理完後的细胞没有马上要养 那请问你去分离这一批细胞是为了?? 又因为primary cell是很娇嫩的 尤其是neuronal cells 没有细心照料他都会漂给你看了 现在却还要给他冰起来 或许是我脱离这圈子有点久了(小的目前服役中) 但认知下没有特殊因素的话 处理primary细胞很少会作到冷冻处理的步骤 更何况只有"-70"的处理保存下 大概分享自己经验(primary cortex cell culture) newborn cortex tissue打散分盘後先培养一个礼拜 先观察细胞是否稳定 因刚打下来的细胞是很脆弱的 在确定是否有正常稳固贴附及生长时 是尽量不打扰 再依自己实验需要换medium或其他处理 (细节不谈) : 3.paper上面是写可以culture 28天以上.... : 想要请教大家, new born的神经,在培养的时候,他的数量(生长)会增加吗? : 还是他只能分化?最多可以培养多久(或几代??)有没有什麽特别要注意的~ : 以增加存活率?...因为到时候要electroporation...怕细胞不够到时候 : 全没了@@ 纯neuronal cell是没尝试过养这麽久 但养过的mixed primary culture cells中 养到第28天的几乎都是glia cells; neuron population很低 所以请自行查阅想养的细胞特性 另在brain tissue中 可以分生分化的blast cells是很少的 少到我们实验室都是忽略他们的存在 而且一般的medium无法有效的激活他们 除非你们有作特地的处理 所以大致上都视作 数量密度维持恒定 至少只会减少不会增加 所以还没听过可以养"几代"这种话 只有分过astrocyte & microglia 但好像没有"代"差别在 : 4.跟细胞培养无关的问题@@ : 我有爬文 : 但是还是想问问.....关於新生mice mark的问题 : 带我的老师要我剪小鼠的脚趾.....有一些小鼠 : 会养超过半年....当他们长大之後 : 我要把它们抓起来~肚子朝上才能看脚趾 : 但是我有一点恐惧症~我敢抓尾巴,但是不敢抓他们的neck : 所以现在正在练习怎麽把它们抓起来check 他们的脚趾 : 我的情况还蛮严重的 : 每次一碰到他们的脖子我都会有退缩反射 : 目前还不成功~我正在努力克服 : 但是可能需要一段时间 : ~所以想要请教大家 : 有没有其他mark的方法 : 可以持续半年 剪耳标试看看吧 : 又适合我目前的情况??(只要编号一到五) : (如果可以的话有没有方法可以编号1到99@@??) : 我是个新手菜鸟 : 这方面的知识我还不大懂~希望大大能够教教我~或是给我ㄧ个指引 : 各诉我哪边可以习得相关知识.... : 先谢谢大家的帮忙了........感恩~^^ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 210.59.163.142 ※ 编辑: ltck 来自: 210.59.163.142 (06/01 10:45)