※ 引述《powergen85 (Uma)》之铭言： : ※ 引述《cuteyinyin (泰迪小熊 )》之铭言： : : 各位大大安安: : : PI最近给我一个任务 : : 要我culture "cerebullum of new born mice" : : 他应该是要培养神经细胞 : : 之後要用electroporation 把DNA送进神经里面...... : : 但是我之前完全没有primary culture cell的经验 : : 所以想跟大家请教几个我查不到答案~ : : 还有不大确定答案的问题 : : 1.因为我第一次做,很不熟练, : : 所以一开始花了很多时间(大约要半小时/per mice@@) : : 在取出小脑,去掉脑膜,显微镜下切成小块这些步骤.... : : 不知道我花这麽久的时间,会不会让细胞死了一大半??(我再切的时候 : : 细胞是放在culture medium之中....medium 是依照protocol配置的) : : 如果我做太久会导致细胞大量死掉的话,有没有其他方法可以补救? : : (没办法我ㄧ开始真的是手残不协调...我也很想快点弄完) : 我也不算是新手,不过我的实验材料也是primary neuronal culture, : 所以我想可以提供我的经验... : 一般来说,neuron是不会再分裂的细胞,而且还蛮脆弱的, : 所以我都是在冰上完成dissection,然後把马上种到PDL-coated plate, : 整个过程,快的话也是不会超过半个小时... 小的不才，也刚好做过primary culcure 但我做的是取DRG，也就是背根神经节 一次大概快要两小时，一次约5-8只 取下後马上放在冰上的HBSS buffer 里 直至全部取完 之後也是跟powergen85一样，马上种下去养 只是我的plate条件不太一样，coating的是poly D lysine 跟 Laminin 但是因为DRG的神经细胞纯度不似brain好，还要再加药阻碍fibroblast的生长 : : 2.切完之後,因为没有马上要culture,所以依照protocol上面的叙述 : : 把他们cryopreserve...冷冻在-70(加DMSO)....但是因为我一次要 : : 牺牲五六只老鼠,cryoperserve box又不够,所以我每做完一只 : : 是放在冰里面,等全部的sample都弄完了再一起放进-70 : : 上次我ㄧ共花了三个小时才做完全部><(五只)...请问 : : 这样子细胞会死光吗??还有~我问我们那边的博士後~他跟我说 : : (他是日本人)在他们那边,他们神经细胞不冰-70度, : : 都是马上culture起来,因为神经细胞冰起来很容易死掉 : : 就算是放了DMSO也一样...但是因为paper上面是写可以冰起来 : : 我又查不道这方面的资讯..所以想要确认一下哪个才是对的>//< : 跟你赌,一定会死光... : 原因也是像1. 所说的, 我们lab隔壁的助理之前还把primary culture在DIV4时分盘, : 结果当然是细胞全部飘起来给他看..... : 可以告诉我paper的title吗? 这边我想，应该也不太适合冻起来 因为我没有冻过 取下的神经细胞，状况良好的话，可以维持两周(一定要加NGF) 但是之後神经细胞会逐渐变少，因为不会生长及有其他细胞抢养分的关系 : : 3.paper上面是写可以culture 28天以上... : : 想要请教大家, new born的神经,在培养的时候,他的数量(生长)会增加吗? : : 还是他只能分化?最多可以培养多久(或几代??)有没有什麽特别要注意的~ : : 以增加存活率?...因为到时候要electroporation...怕细胞不够到时候 : : 全没了@@ : 如果你要养glial cell,好像可以分3~4代没问题,不过要用特定的medium去筛, : neuron的话,只有在neocortex的地方,有具有分裂能力的细胞, : 所以基本上,作primary neuronal culture只能认命的牺牲pup来作... 我们只使用两周内的新鲜神经细胞来做实验 毕竟状况很难维持(这边是指神经的纯度要高) 28天确实有养过，也还活着，但是我们的目标是不加药去培养神经细胞 这就有难度(或是我不知道有什麽好方法) 所以要实验都要新取(这点真的很辛苦，老鼠也是) : : 4.跟细胞培养无关的问题@@ : : 我有爬文 : : 但是还是想问问.....关於新生mice mark的问题 : : 带我的老师要我剪小鼠的脚趾.....有一些小鼠 : : 会养超过半年....当他们长大之後 : : 我要把它们抓起来~肚子朝上才能看脚趾 : : 但是我有一点恐惧症~我敢抓尾巴,但是不敢抓他们的neck : : 所以现在正在练习怎麽把它们抓起来check 他们的脚趾 : : 我的情况还蛮严重的 : : 每次一碰到他们的脖子我都会有退缩反射 : : 目前还不成功~我正在努力克服 : : 但是可能需要一段时间 : : ~所以想要请教大家 : : 有没有其他mark的方法 : : 可以持续半年 : : 又适合我目前的情况??(只要编号一到五) : : (如果可以的话有没有方法可以编号1到99@@??) : : 我是个新手菜鸟 : : 这方面的知识我还不大懂~希望大大能够教教我~或是给我ㄧ个指引 : : 各诉我哪边可以习得相关知识.... : : 先谢谢大家的帮忙了........感恩~^^ 我们实验室的人会用分笼兼画尾巴记号来编号 小cage一笼放个八只，然後可以自己想长短的前後编排在尾巴上做记号 然後笼子编号 这样实验时不会眼花撩乱(一笼只有八只) 也不必跟老鼠脚指搏斗 参考看看罗 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 219.81.161.54 打得太简略怕大家看不懂，补几个字，谢谢。 ※ 编辑: asophisca 来自: 219.81.161.54 (05/30 22:23) ※ 编辑: asophisca 来自: 61.31.175.179 (05/31 21:24)