※ 引述《cuteyinyin (泰迪小熊 )》之铭言： : 各位大大安安: : PI最近给我一个任务 : 要我culture "cerebullum of new born mice" : 他应该是要培养神经细胞 : 之後要用electroporation 把DNA送进神经里面...... : 但是我之前完全没有primary culture cell的经验 : 所以想跟大家请教几个我查不到答案~ : 还有不大确定答案的问题 : 1.因为我第一次做,很不熟练, : 所以一开始花了很多时间(大约要半小时/per mice@@) : 在取出小脑,去掉脑膜,显微镜下切成小块这些步骤.... : 不知道我花这麽久的时间,会不会让细胞死了一大半??(我再切的时候 : 细胞是放在culture medium之中....medium 是依照protocol配置的) : 如果我做太久会导致细胞大量死掉的话,有没有其他方法可以补救? : (没办法我ㄧ开始真的是手残不协调...我也很想快点弄完) 我也不算是新手,不过我的实验材料也是primary neuronal culture, 所以我想可以提供我的经验... 一般来说,neuron是不会再分裂的细胞,而且还蛮脆弱的, 所以我都是在冰上完成dissection,然後把马上种到PDL-coated plate, 整个过程,快的话也是不会超过半个小时... : 2.切完之後,因为没有马上要culture,所以依照protocol上面的叙述 : 把他们cryopreserve...冷冻在-70(加DMSO)....但是因为我一次要 : 牺牲五六只老鼠,cryoperserve box又不够,所以我每做完一只 : 是放在冰里面,等全部的sample都弄完了再一起放进-70 : 上次我ㄧ共花了三个小时才做完全部><(五只)...请问 : 这样子细胞会死光吗??还有~我问我们那边的博士後~他跟我说 : (他是日本人)在他们那边,他们神经细胞不冰-70度, : 都是马上culture起来,因为神经细胞冰起来很容易死掉 : 就算是放了DMSO也一样...但是因为paper上面是写可以冰起来 : 我又查不道这方面的资讯..所以想要确认一下哪个才是对的>//< 跟你赌,一定会死光... 原因也是像1. 所说的, 我们lab隔壁的助理之前还把primary culture在DIV4时分盘, 结果当然是细胞全部飘起来给他看..... 可以告诉我paper的title吗? : 3.paper上面是写可以culture 28天以上... : 想要请教大家, new born的神经,在培养的时候,他的数量(生长)会增加吗? : 还是他只能分化?最多可以培养多久(或几代??)有没有什麽特别要注意的~ : 以增加存活率?...因为到时候要electroporation...怕细胞不够到时候 : 全没了@@ 如果你要养glial cell,好像可以分3~4代没问题,不过要用特定的medium去筛, neuron的话,只有在neocortex的地方,有具有分裂能力的细胞, 所以基本上,作primary neuronal culture只能认命的牺牲pup来作... : 4.跟细胞培养无关的问题@@ : 我有爬文 : 但是还是想问问.....关於新生mice mark的问题 : 带我的老师要我剪小鼠的脚趾.....有一些小鼠 : 会养超过半年....当他们长大之後 : 我要把它们抓起来~肚子朝上才能看脚趾 : 但是我有一点恐惧症~我敢抓尾巴,但是不敢抓他们的neck : 所以现在正在练习怎麽把它们抓起来check 他们的脚趾 : 我的情况还蛮严重的 : 每次一碰到他们的脖子我都会有退缩反射 : 目前还不成功~我正在努力克服 : 但是可能需要一段时间 : ~所以想要请教大家 : 有没有其他mark的方法 : 可以持续半年 : 又适合我目前的情况??(只要编号一到五) : (如果可以的话有没有方法可以编号1到99@@??) : 我是个新手菜鸟 : 这方面的知识我还不大懂~希望大大能够教教我~或是给我ㄧ个指引 : 各诉我哪边可以习得相关知识.... : 先谢谢大家的帮忙了........感恩~^^ --

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