原文吃光光..... ------------------------------------------------------------------------- 照您的说法~这应该所谓的半定量PCR (semiquantitative RT-PCR) 现在这种定量方式已经渐渐的被real-time PCR所取代 real-time PCR之所以可以取代半定量 是因为半定量有他的盲点存在 因为理想的PCR公式为 copy number ( N ) = sample (N 0 ) * 2^cycle number 但是这理想公式往往会因为Taq活性下降、dNTP浓度等原因使得PCR无法达到理想值 又因半定量PCR属於end-point侦测 (即跑完PCR=>跑胶=>依亮度回推定量) 因此容易受到 1. pipet error 2.UV-BOX灵敏度 3.PCR起始浓度、cycle数 等因素影响 导致照胶时发现伪阴性(无差异)因而误判为 无差异 ========================以上是骗P弊的前言================================= 因此 如果经费上不是问题的话~我比较建议改采real-time PCR 进行实验 若是想试试看半定量的话~ 请先拿你PCR产物用分光光度计做定量 (请先纯化) 然後做序列稀释 10^-3 10^-4 ..... 10^-8 让产物呈现 10^5 10^4 ..... 10^1 然後取这些浓度的标准品 做 cycle数测试 求得最适cycle数 ex: 10^-3 10^-4 10^-5 ..... 10 C 12 y 14 c 16 l 18 e 20 22 数 24 26 28 ---------------------------------- tube数 10 10 10 以上述的例子看来测试三个浓度就需要做30管PCR了 然後请取适量的PCR产物加等量的dye 在差不多厚度 相同浓度的agarose gel跑胶 (视产物大小，建议2%) EtBr染的时间固定 照胶的条件固定 (光圈、秒数、焦距) 花了这麽大的功夫 终於可以定出"大概"的cycle数及浓度了 -----------------------这是骗钱的後续发展--------------------------------- 先前我的实验也是想先做半定量 然後取差异大的再做相对定量 (想帮教授省钱麻!! 多贴心阿~) (原PO得意貌) 後来做real-time PCR看到图 才惊觉还是被半定量的伪结果给婊了 现在我都sample直接上real-time PCR 1个半小时内等PCR跑完可就解决一批该死的sample了~ 而且又准确，何乐而不为呢? p.s.1 我也是该死的准毕业生，但至今还不晓得是准毕业生 还准延毕生就是了 最近听到一位老师说了一句非常中恳的话 "研究生距离毕业时间越接近，越容易激发出潜能，发现自己是万能的!!" 大家一起加油吧!! p.s.2 real-time PCR怕麻烦怕污染的话 直接买premix就好噜~ p.s.3 另外~RNA抽得好不好，cDNA转得好不好也会影响到定量的结果喔!! --

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