作者lenti (啄木鸟)
看板Biotech
标题Re: [求救] 请问ligation後出现突变的问题
时间Sat May 16 15:20:08 2009
※ 引述《SugarSa (Ｍｒ.)》之铭言：
: 我的实验是用从template当中P出我要的片段再接到vector中
: 但是好不容易接进去之後，挑colony、送定序却发现insert错了两个点
: 由於之前有用同一个template P出序列正确的片段
: 所以可以排除是template问题
: 现在我的问题是
: 现在如果从同一个plate中，再挑新的colony，会有机会挑到对的吗？
: 还是一定要重新P，ligation，整个重来呢？
: 谢谢
问题主要是在PCR, 你可能需要用好一点的taq.
或者, 在PCR mix中, 再外加 Mg2+, 也可以提高PCR 的正确率.
当然, 降低 cycle 数也是可以考虑的.
至於同一个plate是否可以再挑, 当然可以.
虽然有可能挑到正确的, 只是机会较小.
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.66
1F：推 SugarSa:因为我用的是phusion,理论上错误率应该很低才是 05/16 18:10
2F：→ SugarSa:然後我跑30个cycle,不知道为啥会错了两个点 05/16 18:11
3F：推 chvkimo:phusion就不是taq了,基本上应该有prove reading,你应该有 05/16 19:34
4F：→ chvkimo:照说明书设定PCR条件吧~~ 也许在重做一次应该就成功了吧 05/16 19:35
5F：→ chvkimo:错误机率应该没那麽高 05/16 19:35
6F：推 luwbino:你有排除定序错误了吗?不然就多送几个colony噜 05/18 01:06