※ 引述《egoweaver (Hiko)》之铭言： : 小弟最近在做protein expression的实验，用的vector是pET30a和pGEX4T-1 : 第一次养的时候因为在养1ml的时候太早养，怕它长过头所以流程变成： : 1.pick 1 colony(pET/pGEX in BL21) in selective LB, incubate at 37℃(4hr) : 2.In 4℃ refrigerator for ~2hr : 3.dilute 100ul in 100ml of selective LB, incubate at 37℃ (~2hr) : ↑不知道为什麽长很慢 : 所以养比较久。 : 4.Induction(1M IPTG 100ul) : 5.Incubate at 37℃ (13hr) : 结果最後induction和no-induction跑SDS-Page的结果看不出来有什麽不同，感觉没有成功 : induction，学长建议我改25℃其他condition不变再养一次试试看。 : 第二次的流程和第一次一样，除了1ml的菌液没有进冰箱，然後induction後改成25℃养， : 这次induction就有起来(虽然我觉得我太晚induction了，觉得时机很不好拿捏……)，不 : 过做出来的protein都是insoluble form。 : 我应该要怎麽改下次养的condition比较有机会做出soluble form的protein呢？ : ．在板上看到有人把温度降到18℃在养，这样子是要养比较久是吗？ : ．学长建议我把养的时间缩短看看会不会不是全部的protein都进inclusion body。 : ．老师觉得把Medium换成M9有机会做出soluble form，但是老师说他觉得我不管怎麽试机 : 会都不大Orz 首先, 你induction的时机,菌液必须要达到 OD600 0.6~0.8. 以你敍述的培养条件, 我看你的菌液不可能达到那个吸光值. 其次, 你说的降低培养温度当然也是一个做法, 但降低 IPTG induction 浓度更重要. 由你用的 1 M 降低至 0.1 mM ~ 1 mM. 此外，还可以改善的方法是, 在lysis buffer中加些component. 最直接的方法是用 denature 方式把inclusion body中的protein 溶解出来, 再将buffer 置换, 让protein refolding回去. 这个方法的好处是可以得到大量的蛋白, 缺点是, 可能会造成protein misfolding 而可能造成你的蛋白失去活性. 另外, 就是在Lysis Buffer 中, 增加下列配方. 1. 200 mM ~ 300 mM NaCl 2. 5~15% glycerol 3. 1~5 mM DTT / beta-mercaptoethanol 4. 0.1 ~ 0.2 % Triton X-100 的确可以增加 inclusion body 中蛋白的溶出率. --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.125.66