作者egoweaver (Hiko)
看板Biotech
标题[求救] Recombinant protein expression
时间Wed Apr 22 18:26:48 2009
小弟最近在做protein expression的实验，用的vector是pET30a和pGEX4T-1
第一次养的时候因为在养1ml的时候太早养，怕它长过头所以流程变成：
1.pick 1 colony(pET/pGEX in BL21) in selective LB, incubate at 37℃(4hr)
2.In 4℃ refrigerator for ~2hr
3.dilute 100ul in 100ml of selective LB, incubate at 37℃ (~2hr)
↑不知道为什麽长很慢
所以养比较久。
4.Induction(1M IPTG 100ul)
5.Incubate at 37℃ (13hr)
结果最後induction和no-induction跑SDS-Page的结果看不出来有什麽不同，感觉没有成功
induction，学长建议我改25℃其他condition不变再养一次试试看。
第二次的流程和第一次一样，除了1ml的菌液没有进冰箱，然後induction後改成25℃养，
这次induction就有起来(虽然我觉得我太晚induction了，觉得时机很不好拿捏……)，不
过做出来的protein都是insoluble form。
我应该要怎麽改下次养的condition比较有机会做出soluble form的protein呢？
．在板上看到有人把温度降到18℃在养，这样子是要养比较久是吗？
．学长建议我把养的时间缩短看看会不会不是全部的protein都进inclusion body。
．老师觉得把Medium换成M9有机会做出soluble form，但是老师说他觉得我不管怎麽试机
会都不大Orz
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顺便问一下，菌液的英文怎麽讲啊……
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◆ From: 140.112.244.194
1F：推 kshsdeck:蛋白表现的很多可能性都要试了才知道,蛮碰运气的 04/22 18:49
2F：推 alaric:测一下OD. 在0.6-0.8时才加IPTG. IPTG可以放少些. 04/22 19:39
3F：推 alaric:抓条件,养1ml expression看看... 04/22 19:42
4F：→ egoweaver:之前原本有想养1ml 不过学长姊说他们经验是等到养100ml 04/22 20:20
5F：→ egoweaver:还是得再调condition，结果就变成很奢侈的直接养100ml了 04/22 20:21
6F：→ egoweaver:直接把菌液拿去测OD吗?可以用平常的cuvette不会污染?觉 04/22 20:22
7F：→ egoweaver:得怕怕的||| 对於没做过的事orz 04/22 20:22
8F：推 bluecsky:E.coli吗? 100ml一点都不奢侈欧XD..在我待的lab 6L是基本 04/22 20:57
9F：→ bluecsky:阿 不过你是测condition而已..可以在养少一点吧 04/22 20:57
10F：→ egoweaver:对啊||| 不过我只是要做少量去immunization 所以100ml就 04/22 22:05
11F：→ egoweaver:是正式养的量了……可以放6L的incubator感觉很酷XD 04/22 22:05
12F：推 alaric:也只是取1ml去测个OD. 抓条件是必要的.. 04/24 20:38
13F：推 wt1seven:IPTG可低到1 microM 或改用含GROEL系列的菌株 试renature 04/24 22:47