※ 引述《YuDavid (讨厌失眠)》之铭言： : 发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出 : 以方便板友帮您追踪问题 : ----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章---- : 大家好 : 我们为了观察CD4+细胞有没有到特定的部位(我们的实验是鱼类的肠子) : 选择Immunohistochemisrty的方法 : 希望能顺利追踪到抗原 : 这几次实验 却总是不太成功想请教一下大家 : 首先我们是用石蜡切片 把鱼类肠道固定後 : 先deparaffinized by xylene and rehygrate : 接下来是做Antigen Retrieval : 这一步是我很头痛的 : 因为查到的protocol都写说 用Sodium Citrate buffer 浸泡後拿去加热 : 许多人是用微波炉 : 但是我只要一加热 可能buffer沸腾的关系 sample都会从slide上脱落 : 步知道有没有人发生过类似的问题并且如何解决? 以antigen retrieval来说的话 用微波炉做为热源应该是要尽量避免 因为受热不均匀又有沸腾的问题 除了怕脱落外 buffer的浓度与pH也较容易改变 一般病理科都会买IHC专用的压力锅 市面上有卖专用的压力锅 不过那个一个好像四,五万以上 省钱的做法就是用autoclave 如果你的机器可以选择模式的话 要用液体模式 也就是降温过程不会泄压 即可到达retrival的温度又不会使溶液沸腾 效果可以比得上压力锅 : 另外 我们是用DAB显色 : 加抗体前也会用goat serum做block : 浓度是serum/PBS=5% : 并且一抗二抗也是用这种浓度的serum按照1:100稀释 : DAB 则是与PBS按照1:20的比例稀世的 : 然而实验做完後 : 细胞核透过hematoxylin染色 还蛮清楚乾净的 : 就是没有DAB显色後的黄褐色出现 : 请问我实验方法有甚麽不妥之处吗 谢谢大家! block最好是用与二抗同源的血清 不过有些tissue用milk即可 negative control 要用与一抗同源的血清 positive control的话 这个难说 染不出来不一定是实验步骤的问题 很多抗体是不能拿来做IHC的 请注意你的抗体是否有注明可用 我知道sigma有专门出IHC和tissue array专用的抗体 不过也比较贵一点 这网站还有个不错的地方 就是它会告诉你哪些tissue或cell会是positive 请去想办法搞来当作control DAB的话 加下去之後如果过了五分钟还看不到明显的黄核色 多半就不行了 放再久也会是false positive --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.133.6