作者meigue (东小姐)
看板Biotech
标题[求救] 请问关於sequencing中加入dGTP
时间Tue Mar 24 01:15:51 2009
请问版上各位先进，不知是否有遇过以下的情况
送定序时，怀疑plasmid会有二级结构，因此在定序时加入dGTP
但定序出来的结果反而不符自己的期待？ 即序列跑出我不认识的序列
先说明送定序前的作业:
小妹我将PCR product clone进pGEM-T vector
隔天利用colony PCR挑有insert的colony，养菌抽plasmid，之後送T7定序
定序时告知操作人员会有二级结构
我总共送两批，第一批只有加enhancer时，定序出来的结果是我的序列
但定序效果不甚佳
所以送第二批定序时，操作人员帮加了dGTP，但却出现不认识的序列
现在想请问各位到底是那边出了问题，我想到的可能性有几种列在下面
1. T7 promoter本身不是很好的定序primer，所以下次换SP6看看
2. dGTP虽会缓解二级结构的问题，但本身也会对定序造成不良影响
3. Plasmid是空包弹，所以定不出来 (关於这一点可能性较小，因第一批已经有结果)
希望听听大家的意见，小妹在此先谢过了。
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