※ 引述《sweetapril (sweetapril)》之铭言： : 想请问大家在做western时, : 1. 同一批sample会压几次呢?? (所谓的2重复 3重复是什麽意思呢?跟n值一样吗) : 若"第一次"所压的5管sample就有想看的趋势了,大家还会将这5管sample再压一次吗? : 还是再重新收另一批sample来增加 n 值呢? 我会重新收一批耶 如果sample第一次压就把想收的data都收齐了 我就不会再跑第二次了 浪费时间 : 2. 一抗的部份,如果overnight超过48小时,对蛋白表现会有不好的影响吗? : 以 Rho A 为例,之前试过O/N 16小时 --- 影像不明显 (一抗1:500, 二抗1:5000) : O/N 24-36小时--影像较清晰了(一抗1:500, 二抗1:5000) 我不知道Rho A好不好压 但是我觉得一抗的时间16跟24hr 效果是差不了太多的 你可能要想想 是不是protein含量很少 是的话看要不要增加loading的protein量 或是用的一抗比例的关系 或者你一抗是用什麽buffer稀释也有影响 : 3. 如果要跑分子量20-26kd,制15%的胶会比较好吗?? : 我现在都跑12%的胶,但因为要看的分子量下方有一条很近的杂band, : 跑到跳海了,还是没办法分的很开 = =/// 用15%跑会比较好 我之前实验有要看14kd的protein 用12%跑也是跟你一样 会跟最下面的杂band很接近 但是15%的胶要跑得漂亮要用低电压跑 我都用80V跑2.5hr 这样band很直很紮实 不会晕开或拖尾巴 : 4. 低分子量时,通常transfer的 伏特数和时间 是用多少呢? : (Rho A--24kd-- 我用100V,60分钟,这样会太少or太久吗?) : 谢谢^^ 低分子量我不会改transfer的时间耶 我都用400mA 60min也是没问题(14kd的protein) --

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