作者theessential (...)
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标题[求救] 关於protein purification
时间Mon Jan 12 01:27:11 2009
先谢谢大家进来看我的问题~^^"
我想要纯化出来的protein大小约52kD
induction後 也跑过PAGE确认想要的protein有被induced出来 并且在对的位置
是以French Press破菌
这个protein学姊之前有纯化过
差别便在於後来後来在C端接了个tag
由於之前学姐所用的是denature的condition
所以我所使用要通column的buffer全部都含6M Urea
可是我在纯化时却没有办法elute到足量的protein
收集了破菌後的supernatant与通过column後相比较
发现protein几乎没有binding上去
SDS-PAGE上 elution的部份根本看不见...@@"
後来做了Western
发现elution部分有protein
但是和column流出的相较 真的是很少很少
这是我使用的binding buffer配方:
5mM Imidazole
0.5M NaCl
20mM Tris-HCl
6M Urea 调整pH至7.9 (按Novagen His-Bind Resin column protocol指示)
所使用的所有buffer都确定过pH值无误
也曾纯化过在同一个plasmid上一定会被E.coli(BL21 DE3)表现的蛋白
可以成功的纯化出来
也有将plasmid送去sequence 也确定His tag及所要的protein存在
现在找不出来protein为何会无法binding到column上
总觉得5mM Imidazole已经很低了
还是说应该试一试不含imidazole的binding buffer呢?
(但是会怕non-specific binding...)
建议调pH值吗? 该怎麽调比较恰当呢?
或着有其他的建议?
因为是新手 经验不多
拜托大家帮忙了
谢谢大家!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.62.101
1F：推 pupuwu:1. Ni-NTA resin是reuse的吗?괠 01/12 09:50
2F：→ pupuwu:若是，上次用毕是否有用高浓度imidazole(500 mM)洗乾净? 01/12 09:51
3F：→ pupuwu:我使用的denature condition参照qiagen 配方没有imidazole 01/12 09:52
4F：→ pupuwu:但是binding buf内有0~20 mM imidazole理论上会增加专一性 01/12 09:53
5F：→ pupuwu:应该不至於会使蛋白无法binding 01/12 09:53
6F：推 pupuwu:可以说一下你的菌量和resin的体积和wash条件吗? 01/12 09:55
7F：→ pupuwu:是否是超过column能力 所以flow through很多 01/12 09:56
8F：→ pupuwu:或是wash就都洗掉了?? 01/12 09:56
9F：推 liuse:我想到的是C端接的His-tag 有没可能没露出来 被埋起来了 01/12 11:15
10F：→ liuse:所以Ni-resin抓不到 再确定实验步骤都没问题後 有可能是这样 01/12 11:16
11F：→ liuse:ㄟ 我搞笑了 你是denature condition 01/12 11:17
12F：推 wcegg:有没可能根本是his-tag fram shift !? 01/20 13:49
13F：→ wcegg:frame ... 01/20 13:50