※ 引述《nidus (咕叽)》之铭言： : 实验流程大略如下： : ligation以及图菌後 : 隔天长出colony : 挑单一colony做cloning PCR : 检测是否目标基因有接进vector中 : 而我遇到的情况是cloning PCR检测有看到目标基因被放大 : 而我将该菌珠培养O/N後 隔天抽plasmid : 再做enzyme digestion 结果却切不出那段基因出来 : 而且plasmid的位子好像在空的vector位子 : 送定序出来的结果也很诡异 : ps我利用vector上的CMV30为primer 定序结果不到没有我塞进去的gene : 序列也跟vector不同 : 请问有人遇到跟我类似的状况吗？？ 我自己之前的实验遇过相类似的问题 colony PCR有目标产物 大小也接近 不过作enzyme digestion却没做出来 再回头抽plasmid 及再作PCR 确定目标产物有量化後 因为enzyme digestion没结果 所以我是利用目标序列内部的primer 作了好几组的PCR 例如目标序列全长是1500bp 那内部有的primer有的可以夹出500bp 有的可以夹出700等等 再加上全长1500bp的都有确实量化出我预期的产物 所以才比较确定应该是有接近去的 然後才送定序 而enzyme digestion作不出来有可能是实验流程问题 也有可能是酵素问题 也有可能一些甲基化 造成那个切位酵素切不动 也有可能是个人技术问题 总之可能要一步一步检讨 但是送定序的话 如果出来的结果 却连vector也有问题的话 考虑一下 不要只有一家厂商合作 因为有些时候是有可能有一些失误的 之前新闻连亲子亲缘监定都有错 当然也要检讨是否问题出在自己 送的样品是否无污染 浓度是否足够 有的厂商除了送plasmid 也可以送菌液请他们代为纯化後再定序 另外要考量一点 因为送定序要花钱 所以最好还是能多作几步确定有接进去东西 再去做定序 不然定序出来比对不到片段 也很囧 --

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