打算作bacillus megaterium的competent cell 以为药品都准备好了 结果少了proline>< 有人在新竹可以借我1g吗 星期一可以归还(sigma的) 还是有其他amino acid适用的话可以告诉我吗 很想赶快知道transform的结果QQ ------------- 把步骤写出来 其中有什麽不妥的地方 也请大家不吝指教 ------------- 药品配制: 1.2X AB3(antibiotic medium NO3):7g溶於200mL水中 高温灭菌 2.2X SMM: 1Msucrose 40mM sodium maleinate 40mM MgCl2 pH=6.5 高温灭菌 1+2等体积混合得SMMP 3.PEG-P:40% PEG6000 in SMMP 4.CR5 topagar 500mL: a.10.2g sucrose 3.25g MOPS 0.33g NaOH pH=7.3 体积250mL 高温灭菌 b.2g agar 0.1g casmino acid 5g yeast extract 体积142.5mL 高温灭菌 c.57.5mL 8X CR5 salt 25mL 12%proline(过滤) 25mL 8%glucose(过滤) CR5 salt 8X stock(625mL):1.25g K2SO4 50gMgCl2．6H2O 0.25gKH2PO4 11gCaCl2．H2O 5.将a跟b混合维持50度C 再加入b维持42~43度C ------------- protoplast 制备 1.将B.megaterium single colony 接进50mL LB medium 培养至OD600=1 2.3000rpm 25度C 离心10分钟 除去上层液 以5mL SMMP回溶 3.加入Lysozyme 10mg 37度C 70rpm 震荡120分钟 4.3000rpm 25度C 离心10分钟 除去上层液 以5mL SMMP回溶 再次离心 除去上层液 5.加入含有10% glycerol的 SMMP 回溶菌体 每500uL分装成一管 -80冷冻 ------------- Transform 1.取0.5~1 ug DNA 与500uL protoplast混合 加入1.5mL PEG-P 放置室温2分钟 2.加入5mL SMMP 3000rpm 25度C 离心10分钟 除去上层液 以0.5mL SMMP回溶 3.37度C 70rpm培养120分钟 4.取2.5mL CR5-top agar 於无菌试管中,加入50uL菌液 5.将菌液涂在含tetracycline的LB agar plate 37度C培养12~24小时 6.将菌落於两天内在新的培养基上涂开 --

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