※ 引述《charlielg (chi)》之铭言： : 1.大肠杆菌是目前表现外源基因最常用的系统,然而大肠杆菌表现系统常遇到 : inclusion body的问题,他是一种不可溶物质,这里所谓不可溶是指不可溶於水 : 还是不可溶於任何溶液? 其实不可溶物质这句话就有点怪怪的 因为还是可以藉由强烈的还原剂让蛋白质溶在水中 比较偏向inclusion body这个大分子集团在细胞液中是不可溶 但protein则不一定 : 2.inclusion body是因为构型摺叠不正确而使其变成一种不可溶物质,因而造成活 : 性不佳,那是否当inclusion body变成可溶性也就代表活性会提升呢? inclusion body形成我觉得可以分成几个方向来讨论 第一个是protein在E.coli中是可以被正确folding 但是因为制造速度太快 在folding的尝试过程中会因为分子间的距离太近 使得数个protein分子的hydrophobic domain互相黏在一起变大分子团 这种情况下我想降低温度或IPTG浓度避免inclusion body 之後产生的protein活性会提升 第二种是在E.coli中无法正确folding 分子量太大或者太复杂导致怎样尝试都无法正确folding 或者E.coli的chaperone不赏脸不想帮 disulfide bond也不赏脸 O/E的protein hydrophobic domain一堆 Charge也一堆 这种我想就算想办法让他不要形成OB 但是做出来的protein也没function 第三种是O/E的protein对E.coli有cytotoxic所以把它聚集起来 这种让它不会形成OB..就换成E.coli死给你看 : 3.利用大肠杆菌来表现真核基因时,所表现出来的蛋白质会跟native form会差很多 : 吗?如果会,那为何在很多实验中还是要利用此系统呢?除了此系统便宜培养容易 : 及了解较深入之外,有其他考虑因素吗? 我觉得是要考虑到实验用途............(还有老板的财力) 假如O/E的蛋白没有太多的disulfide bond和太复杂的结构就用E.coli 需要多disulfide bond 微量phosphorylation就用Yeast 再需要多phosphorylation 微量Glycoslation就换Insect 要全部功能就用Mammalia cell =口=b 假如要研究的只是某个domain或motif也不需要用到full protein表现 就单纯用E.coli 弄出那部份就好 (或者黑暗一点的.. 用full protein native form做出来是没结果 科科) 或者在解结构上来说 上述那些post-translation modification会造成更难解析的结果 那到不如找个E.coli可以轻松拿到 又不会有太复杂後修饰的来搞 : 4.此系统最常被用来表现哪一类的外来基因(哪一类的蛋白质)? : 以上这些就是本人疑惑之处,希望这方面高手能为小弟提供点意见,感激万分! 我不是高手 所以也希望有人可以订正或补完 v(￣︶￣)y --

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