作者nidus (咕叽)
看板Biotech
标题<求救>lipofectamine 效率
时间Sun Oct 5 23:30:11 2008
※ [本文转录自 Biology 看板]
作者: nidus (咕叽) 看板: Biology
标题: <求救>lipofectamine 效率
时间: Sun Oct 5 22:49:17 2008
请问有人用过吗？？
我做了好几次效率低到看不到想要表现的protein
我的步骤如下：
genaid抽plasmid 再以酒精沈淀进一步纯化
使用细胞为hela
transfect 前一天在六公分盘种9X10五次方细胞
第二天取500λserum free DMEM 与 3μg plasmid混和
20λlipofectamine与500λserum free DMEM混和 等五分钟
将上述两溶液混和 等20分钟
将混合液倒入昨天seeding好的HeLa cell 六公分盘中
HeLa cell 六公分盘会先以PBS wash两次 以将serum洗掉
六小时候再将medium置换成有serum的DMEM
24小时候收细胞 western检测
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plasmid有提高至8μg 结果还是一样
plasmid也有digest後跑胶 位置也对
只不过我欲表现的protein 并不是一个完整的protein
完整序列有276aa 而我只有取1~120
请问有没有可能是无法folding而被进一步degrate掉？？
以上希望有大大相助 任何建议都好
谢谢
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1F：推 iamrim:你要表现的protein有带tag吗?? 10/06 00:19
2F：→ nidus:有 一组是flag 一组是EGFP 10/06 01:17
3F：推 ckshmin:如果细胞霉浆菌污染效率会很差唷!!要不要试试重解细胞~~ 10/06 21:57