※ 引述《e2653495 (melanogaster)》之铭言： : ※ 引述《HIbaby (燃烧吧! 嗨~北鼻!)》之铭言： : : 标题: Re: [问题] promoter 分析问题 : : 时间: Sun Sep 28 19:23:51 2008 : : 作者: alexflybaal (Evanescance) 站内: PhD : : 标题: Re: [问题] promoter 分析问题 : : 时间: Sun Sep 28 02:10:13 2008 : : 我分享一下我的经验 : : 当你clone到你的promoter後 : : 你应该会用GCG或是像TESS的网站收寻你的调控位置 : : 也有可能藉由其他的paper所提供transcription factor binding site的序列 : : 利用一些像DNA star或是VectroNTI或是workbench等 : : 画出可能的transciption factor binding site的分布 : : 这个部份一定会出现sense以及antisense的分布 : : 不过这是正常的 : : 你应该要搞清楚的是 你现在是进行的cis regulation的研究 : : 实际上你要验证promoter上哪个部分是调控的部份 : : 可以进行几个实验 : : footprinting -- 可以找出promoter上哪些部份会与transcription factor : : 结合, 做出分布, 这个实验不好作, 有时候结果不好看出 : : Dual leuciferase assay -- 这个是promega的kit, 不过还蛮昂贵的, 需要 : : 冷光仪, vector自己买, transfection reagent : : 自己买, 还要避免用到不适合的cell line : : 上面二选一即可 : : EMSA -- 当你找到某个promoter区域可能跟某些transcription factor结合 : : 你可以利用这个实验, 验证某个transcription factor会与你所找到 : : 的区域结合 : : 再来就是一些transcription factor活化, 基因表现的实验 : : 介绍一本不错的书 : : Methods in molecular biology v.130 : : Transcription factor protocols / edited by Martin J. Tymms. : : 里面应该会有你所有会进行promoter研究的实验方法和概念 : : 那麽就预祝实验顺利罗 : ------------------------------------ : 以上A大说法有几个盲点存在: : 1.除了cis-regulation 外,trans-regulation也挺常见的呢! : 2.footprinting和EMSA都属於探讨promoter序列是否有transcription factor binding : 这两种方法才是二选一吧？不然本钱够雄厚的话,拿去用MS打一打也可以知道啦~ 我个人不觉得是2选一 通常是footprinting做完再作EMSA footprinting目的在於大片段(300bp~100bp)地去寻找哪些区域有protein结合在哪边 如果锁定哪些区域的话(这时候长度约50bp-15bp之间) 再用EMSA去找是哪种蛋白质结合在上面 不过footprinting非常难作，能避就避 footprinting是我唯二做过一次後就不想再碰的实验 另一个是2D...颗颗 : 3.luciferase activity assay 只是ㄧ种测试promoter是否具有活性的方法， : 并无法证实factors会与序列binding, : 　luciferase 也只当作reporter gene得一种选择罢了， : reporter gene百百种，B-galactoside, CAT, 或是其他也很常用， : 　为什麽要选一个连带硬体设备都要一起买的kit呢? : 阳春单管luciferase侦测仪要近20万,多管的动辄上百万, : 你们实验室很有钱吗? : 另外,A大介绍的书还真的不错,可惜对於日新月异的技术发展而言,2000出版的内容稍嫌旧了点, : 原理没有问题,不过真要运用做分析,有很多方法都要再改良吧. : 以上,小建言. : : -- : : ◆ From: 118.160.137.199 : : 推 flywind1209:谢谢A大详细的解说 所以两股都要考虑进去罗^^ 09/28 02:12 : : → flywind1209:还少了一个很重要的实验喔>> ChIP 09/28 02:12 : : 推 HIbaby:帮转 biotech 09/28 19:23 : : -- : : ◆ From: 133.11.198.91 : : 推 hajimels:推一个~ 09/29 13:16 : : → hajimels:推原作者及转过来的HIbaby 09/29 13:17 -- http://www.wretch.cc/blog/aggaci http://go2.tw/fmh --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.100.165