老板要我做RT-PCR 先前有demon过一个line RT有成功(第一次做 所以把珍贵的RT产物当PCR取3ul去跑胶) 也有把actin PCR出来(要当quantitative control / internal control) 但要看表现的转殖基因却没有PCR成功 因此觉得很难 又拖了一阵子(觉得不能再拖了) 所以就先取5个lines先RT 前前後後已经PCR+跑胶有六次了 前几次没positive control 老板说这样哪知道是RT没做好 还是PCR的问题 好 所以加了第一次demon做的RT去PCR 结果连要当positive control的line都没成功 但意外的却在第一次没有P出actin的某个line有P出来=.=? 之後也陆陆续续在不同的line都有P出actin 但都没有全部sample都有 为了要达到每个lines都能顺利P出actin当quantitative control 所以已经快起笑了 想请问各位大大有没有必杀条件 actin要夹出的size为504bp --------------------------------- 最近跑的条件是 93度C,1' [93度C,30" 55度C,30" 72度C,20"]*25 72度C,10' 4度C,--- ---------------------------------- 量 cDNA 各2 5'(25uM) 1 3'(25uM) 1 dNTP(10mM) 1 Taq 0.3 buffer 10 ddH2O 补至100出头(多个几ul) ------------------------------------- 100(分成5管,每管20ul) 我有算过浓度了 不知道是条件还需要再修改还是量还要再调? 机器是Bio-rad 绿色的 有大大有必杀就救一下吧>_< 因为搞定这个还有转殖基因的也要搞 T_T 不太想浪费时间在学长姐必P的出来的东西上 拜托了 各位强者! --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.130.87.174