作者ISME0907 (ISME)
看板Biotech
标题[讨论] 有关REAL TIME PCR定量上的问题
时间Wed Sep 17 02:16:46 2008
想跟大家讨论一下~
1.一般在做绝对定量时要做标准曲线也就是说一开始上机时你的DNA/RNA的量就要很准,
而且quality一定要很稳..或者是说每次做RT-PCR时一定要固定用某家的KIT去抽
DNA/RNA而标准曲线用的DNA/RNA也一定要用这一家的KIT..如此一来才不用因为quality
的关系影响到PCR过程..甚至连将RNA转DNA的RT KIT也要固定用同一家..是这样吗?甚至同一个
LOT的KIT更好..(因为就算同一家的KIT..不同LOT的quality也一定会不一样)
那大家是如何确定这一点呢?
2.我觉得在做PCR时template的量也会影响PCR的过程..那假设在建立标准曲线时..所选
择的threshold假设是X好了..等建立好标准曲线..sample要上机了..那这时候的
threshold 还是要选择X吗?还是依机器给的建议选择X1..这样连threshold 都不一样
可以做比较然後算出绝对量吗?还是说要做绝对定量时除了sample要上机..连要建立绝
对量用的DNA/RNA也要一起上机..然後选择一样threshold..但是我觉得一开始template
的量如果不一样..对PCR的效能也会影响其CT值..所以threshold因该也会不一样吧?
3.选择SYBR或Taqman的方式做real time结果一定要只有一个peak..(除了SYBP对Primers
的影响)..所以大家会先去做一般的PCR看有没有杂band..是这样吗?
抱歉..因为我没做过RT PCR..只是单纯好奇..从网路上边学边看的..
希望大家可以为小弟解答一下..^^
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 218.167.65.59
※ 编辑: ISME0907 来自: 218.167.65.59 (09/17 02:17)
1F：推 zoom8080:第3点:就算一班PCR跑胶看起来没杂band，但也许有看不见 09/17 11:39
2F：→ zoom8080:的产物，所以还是以上机为主，不过连跑胶都有杂band，那 09/17 11:40
3F：→ zoom8080:当然primer是不能用的 09/17 11:41
4F：推 soom:第二点：一般是样本跟标准品会同时上机 选择同一个threshold 09/17 11:47