作者JinMinHo0626 (痴呆的小老虎~~MinHo)
看板Biotech
标题Re: [求救]利用共轭显微镜观察细胞内钙离子的实验方法
时间Tue Sep 16 14:22:39 2008
昨天我将已经seeging在3.5cm dish的HEK293细胞
加入 1 ul 5mM fluo-3-AM + 2ul 10% Pluronic F-127(in water)
於总体积1ml Kerbs-Henseleit buffer 中37度避光染色45分钟
之後以Kerbs-Henseleit buffer 清洗三次
再加入Kerbs-Henseleit buffer 1 ml 於37度静置30分钟
这个实验是模仿2003 JBC paper
paper上说当加入methacholine刺激时
HEK293细胞内的钙离子就会变化
现在我遇到的问题就是
当昨天要先用488波长去看细胞有没有染到fluo-3时
在细胞上完全看不到绿色萤光
帮我的老师是说连染剂都没有成功进入细胞
他是说是因为10% Pluronic F-127是溶在水中
而非DMSO 造成无法把flro-3-am完全均匀溶解
且成功带入细胞
我想问的是:
1.DMSO的含量真的会关系到染剂能否进入细胞吗?
2.上面所做的protocol是不是有误?
3.还有更好的方法或比例可以帮助fluo-3混合均匀/增加细胞染色效率?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.139.89
1F：推 babalou:你们的confocal软硬体可以live观察细胞呀? 09/16 21:01
2F：推 Ithilloth:我用过fluo-3染精子细胞内钙离子 要用DMSO去溶fluo-3 09/17 12:41
3F：→ Ithilloth:配成高浓度的stock 每次使用小体积直接加入medium 09/17 12:42
4F：推 Ithilloth:上flow cytometry都很OK DMSO的体积够小就没什麽毒性 09/17 12:47