作者ubersurfer (把扑)
看板Biotech
标题Re: [求救] Transfection
时间Thu Sep 4 16:56:14 2008
※ 引述《skali (德意志冒险中)》之铭言：
: construct 约 10kb
: 试了很多方法转到neuronal cells
: PC12, SHSY5Y, primary neuron
: reagent试过 Lipofectamine 2000, fugene6, lipofectamine LTX
: 效率都极低或根本0
: (同时都有转GFP当control,效率都超过50%以上)
: 请问是因为质粒太大的关系吗?
: 还有什麽方法解决呢??
: 谢谢!
基本上如果是primary culture cell
用Lipo Fugene等化学方法，效率都无法很好
有板友提到用诺贝尔的electroporation Kit (我想应该是Amaxa的那组吧)
很贵，电一次要1000NTD左右，而且仪器也要你借得到。
不过你连Cell line的transfection都作不太出来的话
我觉得很可能是你的construct本身的问题，因为GFP会亮
如果可以的话，你可以再用HEK-293t这株cell line 试试看，这株超容易transfect
construct太大有可能造成plasmid较不易进入细胞核，这时候用electroporation
或是Gene Gun可能比较有效
除了太大之外，你也可以检查你的vector的promoter，是否适合在哺乳动物表现(eg.CMV)
或是有无Tet-on/off的机制，vector是否年代久远，里面有产生奇怪的突变
再来plasmid的纯度据说也都会影响transfection的效率。
参考看看
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◆ From: 123.50.47.29
1F：推 vancent:ㄎㄎ~最近正在用AMAXA的~TRY个CONDITION就要一万五XD 09/04 18:10
2F：推 aceliang:之前有用劲因代理的Microporator，蛮不错的。 09/05 00:01
3F：推 skali:谢谢分享!construct之前已在HEK试过,没问题,CMV promoter! 09/05 04:33
4F：→ skali:看来electroporation应该是最佳选择,不晓得calaium方法如何? 09/05 04:35