作者sdshow (蝶)
看板Biotech
标题[求救] 有关EMSA的问题
时间Wed Sep 3 12:08:56 2008
想请问一下
我们LAB想看CENP-B跟HeLa cell的核蛋白有无interaction
之前好像有clone CENP-B的片段，然後transfection送到HeLa cell中
从fish的data上看，似乎是有interaction，想在利用gel shift 佐证
老师告诉我的方法，就是抽HeLa的核蛋白，然後把之前transfection的clone dna跟
核蛋白作用，然後跑1% agarose gel，在用EtBr染色，如果蛋白跟dna有interaction
就会shift上去。
发现出来的DATA，整个lane是smear, 如果是DNA only或是protein only的lane则不会
看到smear的现像，
这样的data是表示 protein跟dna有interaction吗??
请问一下，这样的方法可行吗
看paper都是跑acrylamide gel，dna也有经过biotin或放射线lable，
我们的这个方法，有没有问题呀~~~~
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◆ From: 140.128.65.234
1F：推 tsubasawolfy:EMSA不是还要用Ab确认蛋白- -? 09/03 12:51
※ 编辑: sdshow 来自: 140.128.65.234 (09/03 13:49)
2F：→ sdshow:我这个应该不用吧，我是知道有人在DNA上lable biotin，然後 09/03 13:52
3F：→ sdshow:用HRP呈色看结果，没用到Ab耶 09/03 13:53
4F：推 sGoat:这应该算是gel shift的结果了吧,因为你并不知道他会怎样与 09/03 15:38
5F：→ sGoat:DNA缠绕,所以只能知道有shift,而不一定是较高或是较低的band 09/03 15:39
6F：→ sGoat:记得要附上DNA only与 protein only的图 09/03 15:40
7F：→ sGoat:不过你要不要拿不会binding的DNA与你的核蛋白作用跑跑看? 09/03 15:42
8F：推 blence:实验没有postive con.的话,说这smear现象为shift是会被钉的 09/03 16:42
9F：→ blence:此外若没有排除核内nuclease干扰我会推测smear是被切碎造成 09/03 16:45
10F：推 milkpa:记得要有一个DNA+BSA的negative control，另外，如果蛋白 09/03 22:47
11F：→ milkpa:质够多的话，多加一点应该结果会更漂亮（如果可以逼近饱和 09/03 22:48
12F：→ milkpa:smear通常是DNA跟蛋白质binding的位置不只一个所造成，当然 09/03 22:49
13F：→ milkpa:这便暂时先不考虑楼上b网友所说nuclease的作用，如果使用 09/03 22:50
14F：→ milkpa:oligo nucleotide进行EMSA，多半都只会有一个shift的片段 09/03 22:51