※ 引述《vita221 (vita)》之铭言： : 最近开始收细胞要跑磷酸化的蛋白质 : 上一次做的时候发现 若先用PBS刮下细胞离心後再加lysis buffer : 测蛋白质浓度时 蛋白质的量非常的少 : 因为要做time course的实验 : 所以收下来的细胞泡在PBS里的时间比较长 : 所以我在想是不是因为这样 所以蛋白质被分解掉了 : 所以想请问大大们 : 如果我直接加lysis buffer的话 : 要加多少的量下去刮呢? : 或者是有其他更好的方法呢? : 谢谢!!! 原po的问题应该是想测不同time course的蛋白质profile吧 大部分都是用PBS洗掉medium去除不必要变因 抽protein之前应该都会先测细胞数吧 细胞数够的话 不妨可以考虑PBS刮 =>PBS WASH => LYSIS BUFFER DEGRATE 大部分应该都是收1*10九次方细胞吧 我自己这样做(再没给药情况下) 最少会加20-50ul lysis buffer PROTEIN CONS一定够作WB 或2d 我自己通常是喜欢固定细胞数啦 如果细胞量不够的话 可能要考虑多养几盘(这种情况可能会发生再给药时候) 我之前做给药的 是先养到大概1*10的6次方 才给药做time coursre 时间拉的够长的话 应该都没问题 不然就是你给药的浓太高度 或是你想做的是段时间的 以上给你参考 看看 有错请指正 ========================================================================== 另外 我是觉得测浓度的问题会比较困扰我 如果PBS残留的话 比较会引响BSA 或BCA 以上是我的一些经验 --

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