作者lainhat (下一个天亮...)
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标题Re: [求救] 请问限制酉每切完忘记去活性
时间Mon Aug 25 15:43:27 2008
※ 引述《A65 (对!我是零食控!)》之铭言：
: 如标题
: 如果我做完限制酉每切完忘记去活性
: 然後就直接拿去做ligation了...
: 请问这种状况是不是一定会失败了呢?
: 还是说有没有什麽办法补救?
: 太悲伤了 >"<
小弟我做ligation做很久了
也看过很多旧文了
但是有没有接起来 到现在还是得靠运气
不同比例(测浓度算莫尔数)
不同总体积(5ul 10ul 20ul 25ul)
不同方式去接(gateway 和 传统接法)
不同transform法(电穿孔 和 热休克)
不同ligase(NEB 和 Promega)
不同菌液量涂盘(200ul 和 浓缩)
不同菌株(XL1-blue 和 Top10)
不同方式纯化DNA(kit回收 或 软胶回收)
不同条件去电菌(伏特 电阻 电容)
不同时间去热休克(30" 60" 90" 120" 150" 180")
不同培养基去养菌
上述都试过了
说起来很可笑 也很没效率 一个construct接一年接起来T.T
看到什麽都还蛮想试看看的
所以...如果限制切完没有失活
然後跑胶用kit回收或软胶phenol/chloroform回收
这样真的会影响到ligation的效率吗?
像ligation接完也是要失活 增加transformation的效率 是同样的道理吗?
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.87.174
1F：推 tsubasawolfy:不太喜欢做cloning原因就是...运气ˊˋ 08/25 16:08
2F：推 sisyphus:接一年实在是很难想像的事情 不过该作inactive还是作吧 08/25 16:24
3F：→ lainhat:目前还在接其他的 所以我没有一天停止cloning过 囧 08/25 16:29
4F：推 sisyphus:要相信自己不是最惨的!!加油!!!!! 08/25 16:32
5F：推 sGoat:=.= 你可能有些东西没有搞懂,去问问有经验或专门在做的人吧 08/25 16:57
6F：→ sGoat:基本上你的两个问题的答案都是不会,就我做的情形来说啦 08/25 16:58
7F：→ sGoat:phenol/chloroform下去蛋白就失活了,kit膜也是黏DNA而已 08/25 16:59
所以sisyphus大大的cloning因为有做inactive所以都蛮顺的吗?
另外老板有试过ligation完 让ligase失活 的确会增加效率 虽然对我来讲没改变
(菌连一颗都没有 无从比较效率问题= =)
最近是怀疑Kit回收的问题 因为据说前人都没有困扰 都是用软胶回收的
所以也可能是有经phenol/chloroform的关系inactive restrict enzyme影响?
到我进来以後大都用Kit硬胶回收 cloning从此一蹶不振 大家都一样没得挑
想知道各位大大的cloning顺的过程 究竟和我的步骤有没有差
毕竟已经要升研三了 这样还蛮尴尬的处境
虽然我相信自己不是最惨的 但也应该算惨的那一群了T.T
麻烦有宝贵经验的大大多指教...先感恩了
※ 编辑: lainhat 来自: 140.130.87.174 (08/25 18:03)
8F：推 alaric:ligation累人, 有时很顺, 有时快发疯了.... 08/25 21:26
9F：→ alaric:今年也很不顺.. 都接不如预期的. 08/25 21:27
10F：推 sisyphus:我不会跟你说因为我有inactive所以实验顺 但是我作实验 08/25 21:36
11F：→ sisyphus:的习惯是 我可以掌握的部份我作到最好 其他由实验之神 08/25 21:37
12F：→ sisyphus:决定 08/25 21:37
13F：推 witchs:请问你的inser$vecor 大小分别是？transformation过程? 08/25 21:46
14F：→ witchs:研三还满惨低..加油！！ 08/25 21:47
15F：→ witchs:加油！我刚开始也是接了半年，之後抓到诀窍後一星期就ok了 08/25 21:49
接好的我就不说了
目前正在接的(算是基因置换而已)
insert(PCR再陆续纯化出来的) 约3.75Kb
-geneA-
/ \
SbfI+BamHI EcoRV+SacII
vector是从一个老板以前的construct 切完约5.3Kb(去掉geneB)
ubiP-ubiI-geneB-nos-pBS
| |
PstI SacII
SbfI和PstI切位一样 所以可算同一切位
听说DNA长短对ligation也有好接不好接的问题?
先前做一年的也是算基因置换 其实家里作法通常是留construct
再依construct去设计primer 话说研一我也是每天抱着愉快的心情去做
(那时刚开始电plasmid都长满满整盘 都觉得很简单又顺利)
直到接完电完隔天看到没长菌就傻了 从此就抱着既期待更怕受伤害的心情过日子了 囧
现在要升研三了连要做的实验分析都还没进行 再这样耗下去实在不行
希望有撇步的大大传授一下 不管怎样有试有希望
现在问题其实蛮多的 我的用ampicillin筛选 时间久了都会长卫星菌落
(虽然大部分是连菌都没长)
同实验室的也有改接kanamycin的vector去避免这种情况
而我已经置换好promoter了(原本不是UbiP) 外加vector内有我的基因切位
所以只好治标不治本 硬着头皮用ampicillin筛选
不过有加强浓度到1.5倍的量 让菌长大颗一点又不至於有卫星菌落
也有换新的菌去做competent cell(怀疑原本的菌有改变 变的有抗性?)
但还是没有改变没长菌的事实 培养基也改用更营养的SOC去recovery
总觉得...很惨阿!
关於witchs大大问的transformation过程
我是取ligation产物(1~3ul)去电
有看过大陆文章对XL1-Blue最佳转型效率是2.5KV 200欧姆 25uF
有去试过
因为原本机器推荐的1380V 125欧姆 50uF都没长菌很困扰(circular form的很多啦)
电前从冰箱拿出competent後置於冰上一段时间自然融化
(老板是说用手温快速融化较好 两者都做过 结果一样没啥变好的迹象 囧)
之後菌和DNA混合後置於冰上一段时间(约5' 最近这样 以前没在等的)去电
电完後用1ml LB 小心冲吸菌至养菌管 37度C shake约30'~60'
(有听说电完直接冲吸 老板说要等约5'~10' 让DNA跑进菌里 都试过 结果一样惨)
当然更先前因为电都没长single colony 所以有改用heat shock的方式做transform
这边我也想问一个问题=o=P
就是heat shock通常是一管eppendorf将DNA加入去做吧
那各位大大会用eppendorf直接去摇 还是 吸至养菌管去摇?
我用eppendorf养感觉底部管壁都有沉淀物 总觉得很怪
有想到跟溶氧量是否有关系 有看好像有说无氧呼吸菌容易长怪东西?
跟学弟讨论 他是觉得短时间(30'~60')应该没差
大概就是这样了 欢迎指教
※ 编辑: lainhat 来自: 140.130.87.174 (08/26 05:41)
16F：推 sGoat:那是细菌不是沉淀物阿~~~ 08/26 08:21
17F：推 tsubasawolfy:competent cell不能用手摸 囧 08/26 08:35
18F：推 sGoat:可以啦,只是回温太快会影响效率,建议原PO每步都做control 08/26 08:38
19F：→ sGoat:试过一次就知道是哪里出问题 08/26 08:38
20F：推 sGoat:在你的每一个步骤都以空vector做相同的实验作为对照 08/26 08:52
21F：→ sGoat:太长的plasmid会有长出来的菌较小的情形,养16小时还是可以挑 08/26 08:54
22F：推 sGoat:amp浓度为100μg/ml,最多让你养16hr就会长杂菌,太久都不要用 08/26 08:59
23F：→ sGoat:还有看一下切完剪接是不是需要做去磷酸化的步骤 08/26 09:00
24F：→ lainhat:感谢大大的热心建议^^ 08/26 17:19