最近在clone一些转录因子大小约1-3kb左右 先简述一下我如何clone…Orz 1.先确定这些基在老鼠身上，何时、何处会表现？ 2.利用invitrogen Trizol萃取RNA 3.利用Bio-Rad iScript-cDNA-Synthesis合成cDNA 4.设计primer(长度约30左右，因有加RE site) QA：不知道是我设计的primer专一性不够高或是其它 原因，PCR完之後跑胶会有很多band？已试过 gradient temp，还是有很多band…Orz，所以我 　　直接切下我要的大小片段的gel，之後subclone 　　到Topo vector上，在colony PCR及enzyme digestion 中，其片段大小都是正确的… QB：我成功ligation几个gene到vector上，定序之後 发现只有primer序列是对的，而中间序列完全是 错的，与老板讨论之後，有可能是genomic DNA 污染了？ QC：回头看看合成cDNA用的kit，说明书上写最佳合成 片段约1kb，但是有我clone出正确的gene约1.5kb ，是这个原因造成我有些gene，clone出来是错误 的序列吗？ QD：有人知道reverse transcriptase的合成速率吗？ 一般的incubation时间只要一小时左右，这样要 clone大片段gene会clone的出来吗？可以推荐 clone专用的reverse transcriptase吗？ 　　　　　　　　　　　　　以上感谢各位回答…谢谢 --

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