作者lazyQ (认真过每一天)
看板Biotech
标题[求救] primer anneal
时间Thu Aug 14 15:31:45 2008
需要做一个cloning，使用2个primer 去anneal出我要的基因(这个
基因很短)，为了方便ligation，2个primer各有一个cuting site。
primer A: Tm:73.5℃
5' 3'
TTAAGCTTAGAAGGAGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCT
------ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
HindIII overlap
primer B: Tm:75.8℃
5' 3'
AAGGATCCTCTCCGGTGGTATCTGGGAGCCAGAGTAGCAGGAGGAAGAGAAGCTG
------ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
BamHI overlap
overlap:是我要anneal出来的基因片段
请问我要怎麽样才能成功的anneal这两个primer？
并且可以在agarose gel看到清楚的band呢？
目前都只能看到一团糊糊的，不像正常的DNA电泳跑出来的清晰的band
试过1.68~55℃的anneal温度
2.加过2%~10%的DMSO
3.直接拿糊糊的那团去做後续的步骤，可是长不出colony @@~
我想要详细的protocol，谢谢。
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◆ From: 134.208.24.2
1F：推 Fourfish:有先加热denature吗？(好像72度还是更高忘了= =") 08/14 16:01
2F：→ Fourfish:另外vector怎麽处理的？去磷酸吗？ 08/14 16:03
3F：→ lazyQ:有先加热95度denture 5mins 08/14 21:09
4F：推 sGoat:你都作这麽长的primer了,不考虑直接合成一条就好? 08/14 23:35
5F：推 MacBook:可以参考site direct mutagenesis的protocol 08/15 20:25
6F：→ MacBook:先把这两组primer当template(各很少量~25ng) run 10cycles 08/15 20:26
7F：→ MacBook:在把全长的5'和3'ter primer(另外设计)加入继续run15cycle 08/15 20:28
8F：→ MacBook:但这是很笨的做法....你都已经设计这麽长了... 08/15 20:28
9F：→ MacBook:既然基因不长我建议你订购全长的序列正和反股 08/15 20:33
10F：→ MacBook:然後把他anneal起来..孤一下oligonucleotide annealing 08/15 20:33
11F：→ MacBook:就会找到很多protocol了 08/15 20:34