: 跑PCR ，total volume 30，water 19.85，primer Forward and reverse : 各1，10x dNTP 3，10xPCR buffer 3 ，Taq 0.15 ，Template DNA 2 : 以上单位都是ul。但我的DNA浓度品质不一~OD从 40~800 ng/ul : 使用restrition enzyme: PCR products 5，water 16.4，10x Buffer 2 : 50X SAM 0.6，enzyme 1；total volume 25，使用的厂牌是Fermentas : 它的protocal是PCR reaction mixture 10ul(~0.1-0.5ug of DNA) : water 18 ，10X Buffer Tango 2，50XSAM 0.6，enzyme 1-2 PCR的condition似乎没问题（毕竟你都跑出来了...XD） 但Restriction enzyme的浓度有点不对喔！ protocal的体积是20ul 你自己提升到25ul的话 buffer的量也要依比例做调整 : 因为考量到我的PCR products加10会切不完整，~所以才加5，但照我的想法 : 我的DNA量不算太少，切出来应该会很清楚，但不知为何拍出来照片都很淡 : 我一直找不出原因。 你指的很淡是切出来的产物对吧？ 原因是 1.你的DNA已经先被稀释了5X 但这不是最主要的原因... 2.主要的原因是DNA的亮度取决於"片段长度跟量" （简单的说就是nucleotide的量） 片段越短所要达到相同亮度 需要的数量就要更多 你的PCR product被RE切成更小的两个片段 当然两片段的亮度就会下降啦！ 如果想要让RE产物变亮一点就多提高加入的PCR product的量 如果怕RE切的不完全 可以拉长作用时间（1-2hr） 前提是你用的酵素不会因时间太长而乱切XD 再者 建议你做RE reaction时 每隔20-30min做一次spin down跟轻弹的动作 把蒸到盖子上的水气离心回溶液里 以维持正确的浓度 还有一招就是... 因为酵素会逐渐失活 所以在反应时间超过一半之後 再加一点点(0.2-0.5ul就够了)酵素进去 如果你用的酵素很贵的话...我不建议你这样做... 但如果要这样做的话... 那记得不要让你老板知道...XD 以上 希望对你有帮助 祝实验顺利～ --

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