※ 引述《A65 (对!我是零食控!)》之铭言： : ※ 引述《pocheng0227 ()》之铭言： : : 大家好^^ : : 我最近在做tansposon的实验 用的是Tn5的transposon 对象是细菌 : : 目前已经进行到plasmid rescue的阶段 但是遇到瓶颈 想请教有经验的高手 : : 流程大致如下: : : 1.把细菌的genomic DNA用酵素digestion, 3hr. Heat inactivate : : 2.ligation, O/N : : 3.transform到DH5a (heat shock的方式) : : 4.铺盘(含有抗生素kanamycin) : : 接着将盘上长出来的colony养菌, 然後抽plasmid, 可是都抽不出东西 : 长出来的菌没先check过吗? 请问要怎麽check啊? Tn5 transposon含有kanamycin resistant gene, 如果能在kanamycin的盘上长的话, 是不是代表E.coli体内含有Tn5的plasmid啊? : plasmid抽不出来是怎样的抽不出来? : 是没有pellet还是跑不出东西? 有pellet, 是抽出来之後跑胶没东西 : : (这个部分这样做对吗?) : : 我发现transform, 铺盘之後长出来的DH5a, 生长速度很慢 : ^^^^^^^ 印象中这只长出来的很像都不大~ ^^" : : 37度C, O/N长出来的colony很小颗, 我还多放了一天 : : 会不会有可能是污染呢? : : 还是说digestion ligation的过程有可能出问题? : : 感谢回答^^ : 其实这样描述还是很难讲问题出在哪~ : 感觉很像中间略过很多步骤 : 不知道你们是怎麽确定colony的? --

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