作者lorna184 (小宛)
看板Biotech
标题[求救] p-Akt
时间Fri Jul 4 11:11:58 2008
> <....我的p-Akt一直跑不出来...
希望版上的大大可以提供一下宝贵的意见 > <
小妹原本用cell signal的p-Akt,但是压出来片子超乾净的说
後来再try几次,它终於有一点点出现(真的只是一点点),还压了一个多小时
以为抗体有问题,所以就try它们的positive control是有成功的
所以想说会不会因为所有的东西都是for它们的,所以买了abcam的抗体来try
结果........是一样的,所以抗体方面是没问题的,但一点疑惑就是,
两种抗体都是for human 和 mouse,我们用相同的条件做老鼠和人类
老鼠的band超明显,但是人类就不行了,接着就开始寻找问题,
想说会不会是milk或是BSA的浓度太高,以至於把membrane的空缺都给补满了,
所以抗体才抓不上去,原本用 5%安佳blocking 1hr,一抗(1:1000)in 5%BSA 4℃ overnight
,二抗(1:1000)in 5%安佳 RT 1hr
後来尝试 3%安佳blocking 30 min 或不blocking,一抗in 1% or 5%BSA RT 2hr,
二抗都是in 5%安佳,而BSA也用过sigma两种不同cat.来try,结果.....................
.........都是一样的.......压了一个多小时.......有加刺激剂的都超淡淡淡淡淡淡
不知道版上的各位..> <...可以提供小妹其它的做法....感激不尽!!!!!!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.108.117
1F：推 lail:1抗浓度增加,再不行就试看看2抗o/n(浓度不变),参考参考罗^^ 07/04 12:34
2F：推 konlon:用用MILLIPORE的ECL市试试看 07/04 12:56
3F：推 tsubasawolfy:protein怎麽收的? 07/04 13:54
4F：推 adagoddess:一抗 (1:500) over night,隔天回温久一点(2hr) 07/04 14:16
5F：→ adagoddess:Wash时间次数减少，二抗上久一点(2hr)。试试看吧 07/04 14:18
6F：推 liuse:你load多少protein 太少不行的 cell-type也有差 07/04 14:21
7F：→ liuse:cell signalling卖的很好用阿 我们这边也常用 07/04 14:21
8F：推 icome:我做LNCaP pAkt也是超级弱 後来火大把1抗用到1:200就出现了 07/05 08:11
9F：→ lorna184:1:200.....@@"......我先去试试大加的意见看看...多谢!! 07/06 10:51