※ 引述《beavet (beavet)》之铭言： : 请问跑电泳的时後 : 大家的电压会一直往上升吗? : 我们家是用30mV的固定电流 : 但是跑的时候发现电压会从一开始的50左右 一直往上升到200左右 : 这是常态吗? : 有人有过这种情形吗? 跑电泳原理是什麽呢?阴阳离子带电荷吧... 那你长时间的跑完电泳之後不是阴阳离子聚集在正负两极? 那你电泳溶液不就离子分布不均衡?这样不就电阻大? 电阻大不就容易产热?不就热溶胶? 因为你固定电流根据欧姆定律不就要电压上升以维持平衡? : 因为之前看到一个western的troubleshooting里面有写 : 造成fuzzy band的原因可能是high voltage : 但是如果试图把电压调低 : 因为电压会边跑边往上升 : 如果电压上不去 : 电流就会降下来 : 这样子电流不固定 结果反而不好吧? : 那请问应该怎麽改善呢...? 跑大片胶还是小片胶?大片胶通常固定电流,小片胶通常固定电压(没特殊情况的话) PSU固定电压的话电压怎麽会动?有把constant设定在V吗? 如果以你的说法来看电压电流都会动就很奇怪. : 另外造成smeared band的可能原因是hot gel : 请问除了在冷房跑电泳 : 还有什麽方法能够cool down gel呢? : 冰的runnig buffer跑一个小时也是会回到室温的吧... : 那还能怎麽办呢...? 勤劳一点就换Buffer,懒一点就拿冰包住电泳槽. : 电流应该是造成跑电泳会热的原因吧...? : 所以降低电流也是一个方法吗...? 降低电流你会跑更久. : 还有difused band的原因是Excessive protein on gel : (可是那篇文章里面没有附图 : 我不懂"difused band"跟"fuzzy band"有什麽不同... : 感觉都是扩散开来的样子) difused应该是专指loading太多溢到别的lane,fuzzy是指辨识度低,毛毛糊糊揪成一团. : 之前有看到有人问过transfer出来的membrane上 : 相邻的band会相连成一条线 (像两个眉毛变一字眉那样) : 请问这种现象就叫做"difused band"吗? : 因为我也会有这种连成一条的情形 : 但是我觉得原因并不是protein太多... : 是gel没有做好... 都是可能的原因... 但是PAGE毕竟是在溶液中进行,扩散作用是无可避免... : 因为我protein的loading量一直是固定的 : 但有时候会连成一条有时候又不会... : 不过我上下胶都已经让它凝超过一小时了... : 我不懂还有什麽原因会造成这个现象... : 实在苦恼...唉.... : 2.transfer的问题... : 请问大家的PVDF在transfer的前置时 : 泡完MeOH就会完全亲水了吗? : 我们家是用3种transfer buffer的系统 : 处理PVDF的流程是: : MeOH 30sec 活化你的PVDF,你的PVDF说明书上有说明为何要这一步骤 : ↓ : ddwater wash × 2 洗掉MeOH(毕竟你不知道MeOH会对你PAGE造成啥影响) 另外PVDF只有在湿的状态下才会你才能transfer : ↓ : AII buffer泡15min以上 : 我们家买的PVDF一放到MeOH里马上就会变成半透明的颜色没错 : 但是即使过了30秒 甚至1分钟 : 用水洗过後 : 还是没办法亲水耶... : (就是在PVDF上滴buffer的时候 水滴不会散开 是维持一大滴的形状) : 这样是不对的吧? 确定一下你拿的是PVDF吗? : coating没有完全去掉 也去不掉的样子... : 还是大家都是这样?? : 之後是用ECL+冷光仪照相的方式压片 : 不知道为什麽 : membrane常常会有颜色不均匀的现象... : 四周颜色深 中央颜色浅 有没有把片子压平?看起来就像是使用影印机中间没压下去的样子? 在片子後面加一张白纸或是垫厚看看(穿透式扫描机的话不能用这招) : 就是background加上上面的band 整个membrane的颜色会有渐层 : 以至於看起来一样的loading量intensity却不同 : 没办法定量...?/_\... : (需要的话晚点补图...) : 请问这是什麽原因造成的....? : transfer没做好? : 抗体没hy好?? : 感谢大家有耐心的看完我的问题... : 谢谢!!!!! --

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