1.跑电泳的问题... 请问跑电泳的时後 大家的电压会一直往上升吗? 我们家是用30mV的固定电流 但是跑的时候发现电压会从一开始的50左右 一直往上升到200左右 这是常态吗? 有人有过这种情形吗? 因为之前看到一个western的troubleshooting里面有写 造成fuzzy band的原因可能是high voltage 但是如果试图把电压调低 因为电压会边跑边往上升 如果电压上不去 电流就会降下来 这样子电流不固定 结果反而不好吧? 那请问应该怎麽改善呢...? 另外造成smeared band的可能原因是hot gel 请问除了在冷房跑电泳 还有什麽方法能够cool down gel呢? 冰的runnig buffer跑一个小时也是会回到室温的吧... 那还能怎麽办呢...? 电流应该是造成跑电泳会热的原因吧...? 所以降低电流也是一个方法吗...? 还有difused band的原因是Excessive protein on gel (可是那篇文章里面没有附图 我不懂"difused band"跟"fuzzy band"有什麽不同... 感觉都是扩散开来的样子) 之前有看到有人问过transfer出来的membrane上 相邻的band会相连成一条线 (像两个眉毛变一字眉那样) 请问这种现象就叫做"difused band"吗? 因为我也会有这种连成一条的情形 但是我觉得原因并不是protein太多... 是gel没有做好... 因为我protein的loading量一直是固定的 但有时候会连成一条有时候又不会... 不过我上下胶都已经让它凝超过一小时了... 我不懂还有什麽原因会造成这个现象... 实在苦恼...唉.... 2.transfer的问题... 请问大家的PVDF在transfer的前置时 泡完MeOH就会完全亲水了吗? 我们家是用3种transfer buffer的系统 处理PVDF的流程是: MeOH 30sec ↓ ddwater wash × 2 ↓ AII buffer泡15min以上 我们家买的PVDF一放到MeOH里马上就会变成半透明的颜色没错 但是即使过了30秒 甚至1分钟 用水洗过後 还是没办法亲水耶... (就是在PVDF上滴buffer的时候 水滴不会散开 是维持一大滴的形状) 这样是不对的吧? coating没有完全去掉 也去不掉的样子... 还是大家都是这样?? 之後是用ECL+冷光仪照相的方式压片 不知道为什麽 membrane常常会有颜色不均匀的现象... 四周颜色深 中央颜色浅 就是background加上上面的band 整个membrane的颜色会有渐层 以至於看起来一样的loading量intensity却不同 没办法定量...?/_\... (需要的话晚点补图...) 请问这是什麽原因造成的....? transfer没做好? 抗体没hy好?? 感谢大家有耐心的看完我的问题... 谢谢!!!!! -- 唉...不是做实验的料... --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.130.97.111 ※ 编辑: beavet 来自: 140.130.97.111 (07/03 15:59)