※ 引述《owl628 (owl628)》之铭言： : 我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning : 用Tag P出我的要的片段,约1800b.p : 加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用 : (22度西 30分钟) : 接着用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation : 结果做了快10盘,不是没长,就是长的colony抽不出质体 : (养的时候感觉菌液就不是很正常,有点稀) : 抗生素Ampicillin及Kanamycin都用过了 : 不知道有没有人可以给我个建议,麻烦大家了 : 谢谢~ 分享我个人的经验。 我曾经做过一个TA cloning，一个月都做不出来。当时想怎麽可能？TA cloning从大学 做到硕士毕业，没有上百也有数十次，只有colony的多寡，不可能会完全做不出来。 我当时遇到的情形是，比例调得再完美，再细心，就是没有白色的colony，就算是蓝色的 也很少。 这时候可能会觉得是transformation的问题或者是ligation的问题。 很不幸的我做了一个control，只有放vector加ligase去self ligation。实验组就是 有加insert。结果是control组长满了蓝色的colony，实验组只剩10颗蓝色colony，白色 的只有1颗，抽出来check的结果也不是我要的大小。 为什麽呢？因为我放进去的fragment E.coli不喜欢。我猜你的东西八成是病毒的基因 或者是某个很重要的transmembrane protein才会遇到这种情形。 我的建议是，如果只是要用来送进mammalian cell表现，那你可以在你的fragment中间 加一个intron。也就是分成三步骤: 1. N terminal 2. intron 3. C terminal。 这种情形下以我朋友的经验就可以做得出来了。 如果你是要用来纯化protein.. 那你可能要考虑用yeast或者细胞去表现你的protein了。 --

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