作者reteporeh (台风也喜欢放假)
看板Biotech
标题Re: [求救] TA cloning一直失败.....
时间Sun Jun 8 13:52:06 2008
我也用过同家公司的TOPO TA cloning
我做过的话2.2kb都是一次就成功了
都是直接照公司来的protocol做
所以我想你的1.8kb应该是很好接上去的
切胶回收的话我想你的PCR浓度就会降低
而且A' overhang也很容易掉
不过产物比较纯..可以排除掉一些非major的杂band
之後做ligation
transformation长出来的clone数明显会比你直接用PCR的产物去做ligation的少
因为我之前也做过切胶回收跟直接做的
长出来的clone数真的差很多喔
我想你的问题很可能出在competent cell
因为我是用商品化的comptent cell
借其他人的comptent cell来做看看吧
或者借看看其他lab有没有商品化的comptent cell做
因为我觉得competent cell做不好的话
会影响到你之後的transformation
我记得这组TA Cloning kit不便宜喔
相较之下用好ㄧ点的competent cell就很便宜了
※ 引述《owl628 (owl628)》之铭言：
: 我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning
: 用Tag P出我的要的片段,约1800b.p
: 加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用
: (22度西 30分钟)
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^这边的话我是放室温30分钟
: 接着用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation
: 结果做了快10盘,不是没长,就是长的colony抽不出质体
: (养的时候感觉菌液就不是很正常,有点稀)
: 抗生素Ampicillin及Kanamycin都用过了
: 不知道有没有人可以给我个建议,麻烦大家了
: 谢谢~
--
爱情
-----世界上最不需要努力的事情
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 61.227.129.79
※ 编辑: reteporeh 来自: 61.227.129.79 (06/08 14:00)
1F：推 rivis:Taq有proofreading吗？有的话就不会有A 06/08 14:29
2F：推 owl628:Tag没有,pfu才有. 06/08 16:50
3F：推 owl628:请问一下你的PCR产物是直接做ligation吗???连PCR clean up 06/08 17:00
4F：→ owl628:都没做吗???谢谢~ 06/08 17:00
5F：推 yaliu:没clean up出来的clone会很难挑吧...因为dNTP还蛮过量的 06/08 21:31
6F：→ reteporeh:恩..没做..就直接ligation..fresh PCR product只取1ul 06/09 13:39
7F：→ reteporeh:补充一点.我PCR的产物很专一..所以才敢没做回收就直接做 06/09 18:32