小妹目前在作RACE~ 已经是第三run~ (每次试验都有重新抽RNA) 但发生的问题依然相同~~ 先请看图~:) http://www.wretch.cc/album/album.php?id=gwendiline&book=34 相簿叙述有详细说明~ 我使用Clonxxxx的kit~ specific primer设计也没问题 当初已确定定序的基因片段是mRNA 序列 而并非另一股DNA序列 因此是根据mRNA序列去设计的primer~ 并且也先和一般cDNA(非RACE cDNA)进行PCR 可成功夹出我要的片段~ 而问题如图所示 5'-RACE 出现像dimer的片段 (我姑且称为dimer~) 3'-RACE 则出现smear~ 当初我预估整个基因组大约2Kb 因此PCR program： 94℃ 30 sec 60℃ 30 sec 72℃ 3 min 共 35 cycle~ Anealing temp. 偏低 (Protocol 建议 68℃) 原因在於我的primer Tm 仅有52℃ 已考虑加长primer至建议的maximun 28 mer (目前仅有24 mer) 但基本上60℃做得出来 再往上就不确定了 爬文虽得不到答案 但引起我ㄧ些思考 3' RACE的部份： 有板友说smear 是因为基因组太长 所以做出许多大大小小片段 (该板友是回答5' RACE smear的问题) 去NCBI查过 其他植物相同基因组大概2~3 kb 而这3' RACE被夹出的片段 也仅占所有基因组的一部份 extension 目前已经3分钟 故我推测这样的时间应该是够长的.. 当然 我也还没有试更长 还希望板友给意见~~ 或许真的是时间不够长的缘故 5' RACE的部份： 底部出现像dimer的小片段 我已经将我的primer和所有会加到的primer进行比对 (肉眼 + 软体) 基本上是ok的~ 因此我判断底部的小片段 可能是没办法接上的primer所聚集的片段 或是错误的小产物~ 但如果是这样 是什麽原因造成呢? (为什麽会接不上~> <~) 先前我曾经根据我的primer 设计anealing temp 那时候是55℃ 但仍然有相同问题... 所以 应该不是anealing temp 太高的关系吧(?) 以上是我的问题 还请各位前辈能分享经验 帮助我解决~~ 感激不尽~~:D --

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