我算了一下你的primer self dimer, cross dimmer ,hairpin都没什麽问题（或者说真的还不错） primer浓度稍微高了点 你的浓度是400 nM final con. ABI的建议在100~300 nM...这个部分可以试着降低点 And 你是用SYBR Green吗？ 如果有附产物可以在Dissociation curve中看到多个山峰 ※ 引述《apoptosis (good job)》之铭言： : 谢谢大家推文回应 下面是回应推文的问题 : 我们实验室只有我一个人做 很多东西我都不太懂 请教一下前辈 : 1. 我不知道怎麽作melting curve 稍微看了一下 好像是在amplify之後 : 请问软件上面是否就有内建的程式可以跑 我用的是SDS2.0 : 2. 我的primer是别人设计的 : GCGTTCGGCACGGTGTATAA GGCTTTCGGAGATGTTGCTTC : 昨天用beacon designer run了一下 发现是poor =而且有很多dimer : 我发现dimer有一个量化的数delta G 一般介於0到-2 之间 如果没有dimer的话是0 : 我还不太知道那个值有什麽意义 : 我准备定一对没有dimer的primer试试看 : 3. 50 bp的确是比较模糊的一条band 但还是满亮的 : 我准备把primer 降低一倍再试一次 : (原本是10uM primer 取1 ul mixture in 25ul total) : 4. 我用的机器是ABI7900 : 谢谢大家 : ※ 引述《apoptosis (good job)》之铭言： : : 最近作real time遇到困难 : : 我的问题是这样 : : 1.primer + mixture 也有大约20~30 cycle, 我怀疑污染 就去跑胶 : : run gel发现有加cDNA的有两条BAND, : : 一条在100bp 是我的产物 另一条在约50bp 我怀疑是primer dimer. : : 如果不加cDNA 就没有100bp那条 只有50bp : : 现在不知道要怎办 只能redesign primer吗? : : 如下图 : : M cDNA+primer primer only : : 一 : : 一 : : 一 : : 一 : : 一 : : 一 一 : : 一 一 : : 2.我的variation非常大 大概会有3~5个cycle(同一个sample) : : 不知道是不是就是primer dimer造成的. : : 现在一头雾水 请教大家 谢谢 -- 夜生活不只是一种生活，更是一种态度，音乐有很多类型，夜店有很多种类 喜欢与否只是一种偏好，却不代表全部的选择，夜生活的多样与多变应该是 让人有更多更广的眼光看生活与体验......... --

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